Wnt信號通路拮抗劑DKK-1在骨病及骨修復中的研究進展

陳金忠 黃建婷 謝克恭 唐毓金

【關鍵詞】Wnt信號通路;DKK-1;DKK-1Ab;骨病;骨修復

中圖分類號：R68?文獻標志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.12.014

骨骼生長、建模、重塑決定骨骼的結構、質量和生物力學特性。成人的骨量穩態需要骨吸收和骨形成的精確平衡，當這種平衡紊亂后，可能導致骨質疏松癥或骨折修復不良。這些年來，研究成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞在成骨和骨吸收的作用，一直是研究骨病的主題。骨髓來源的間充質干細胞（MSC）作為這些細胞的前體細胞，在分化的過程中受Wnt信號通路的調節。因此作為Wnt通路的抑制劑之一，DKK-1的表達可能與骨質疏松癥、股骨頭壞死和炎性骨病等疾病的發生發展息息相關。通過調控DKK-1的表達可能成為骨病及骨修復合成代謝療法的新靶點。本綜述目的是總結DKK-1在骨病及骨修復的研究進展和DKK-1單克隆抗體在治療骨丟失及骨修復的潛在效用。

1?DKK-1的生物特性

DKK是一種細胞外蛋白，最早發現于無脊椎動物，包括四種不同的形式：DKK-1、DKK-2、DKK-3、DKK-4[1]。DKK-1表達于多種細胞、組織，是四種蛋白中研究最為廣泛的形式，可抑制不同生物和細胞類型的Wnt/β-catenin信號通路。Wnt信號通路轉導有經典與非經典途徑，在多數研究中以經典途徑為主。當Wnt蛋白與卷曲（FZD）受體家族結合形成Wnt-FZD復合物，Wnt-FZD復合物結合低密度脂蛋白相關蛋白（LRP5或LRP6），進而阻止糖原合酶激酶（GSK3）的磷酸化作用，增加細胞核內β-catenin與轉錄因子T細胞因子-4（TCF4）結合并增強靶基因表達。DKK-1與LRP5/6結合后，抑制Wnt-Fz-LRP5/6復合物的形成，從而抑制Wnt信號通路的傳導[2]。最近的數據提供了關于LRP5/6在Wnt信號傳導途經中額外信息，描述LRP5/6受體上不同的配體結合結構域，當DKK-1與LRP5或LRP6的第一個β螺旋槳結合后，抑制Wnt1類信號傳導，LRP6的晶體結構證實LRP6的第三個螺旋槳基序結合DKK-1，但抑制的是Wnt3a類信號傳導[3]。除此之外，DKK-1還與Kremen1和Kremen2蛋白結合。DKK-1與Kremens結合間接與LRP結合形成DKK-1-Kremen-LRP5/6三元復合物后被細胞內化，競爭抑制Fz-LRP5/6復合物的形成，從而抑制經典Wnt信號傳導[4]。

2?DKK-1在骨病中的作用

2.1?DKK-1與骨質疏松

骨質疏松癥主要特征是骨量、骨強度和微結構逐漸喪失，是全球常見疾病之一。過度調節的骨吸收或骨形成可導致原發性或繼發性骨質疏松癥，這個過程主要由成骨細胞和破骨細胞調節。增強成骨細胞分化、活性，抑制破骨細胞分化、活性，是Wnt信號通路調節骨量和維持合成代謝主要機制。DKK-1可以抑制成骨細胞分化、成熟，促進核因子KB配體（RANKL）和骨保護素（OPG）激活劑的表達，RANKL和OPG是負責調節破骨細胞分化的關鍵內源調節因子，增加RANKL/OPG比率可以提高破骨細胞活性，導致骨形成和骨吸收比例失調出現骨質流失[5]。Tian等[6]的研究證實DKK-1表達水平與RANKL/OPG比率呈正相關，這個發現提示DKK-1可能與骨形成無關，但與骨吸收有關。有學者提出DKK-1可能是炎癥反應破壞性的潛在介質，其血清水平與骨吸收、炎癥反應呈正相關，中和DKK-1可以預防炎癥期間的骨質流失[7]。Butler[8]和Coulson[9]等在骨質疏松患者中發現血清DKK-1水平顯著增高，并且與骨密度（BMD）密切相關，證實了DKK-1在骨量丟失中起著負調節作用。但Tian等[6]研究發現，除了絕經后骨質疏松婦女的血清DKK-1水平高于正常絕經婦女之外，并沒有發現DKK-1與骨密度（BMD）呈負相關。另外，Voorzanger-Rousselot等[10]發現血清DKK-1水平和年齡之間無明顯相關性，間接提示骨質疏松癥本身的發病機制導致DKK-1水平增加，而不是因為衰老的原因。長期使用糖皮質激素后成骨細胞DKK-1表達上調，這可能是長期使用糖皮質激素引起骨質疏松癥的機制之一[11]。用反義寡核苷酸（DKK-1-AS）敲除DKK-1的表達后，消除了地塞米松對前成骨細胞中堿性磷酸酶活性和骨鈣素表達的抑制作用，并減輕了地塞米松對骨密度和骨小梁的影響[12]。以上的研究形成了DKK-1抑制骨形成同時促進骨吸收的概念，另外也解釋DKK-1對骨的作用是通過抑制Wnt通路介導的，其直接損害新骨形成和有限的OPG表達，從而改變RANKL/OPG比率以促進骨吸收。

2.2?DKK-1與骨折的修復

骨折由高能量性創傷或脆性增加引起，代表了重大的公共健康問題。骨折不愈合或延遲愈合的發展受到細胞骨生成的局部能力降低影響，這與細胞衰老和DKK-1分泌增加有關[13]。在脛骨骨折的小鼠中發現高表達的DKK-1抑制骨折愈合，通過Wnt3a刺激Wnt信號傳導可以促進小鼠骨折愈合[13]。相反，在動物模型中條件性敲除LRP5或β連環蛋白基因抑制Wnt信號傳導，正常的骨修復被延遲;β連環蛋白基因被敲除后，DKK-1Ab在骨折修復中的作用減弱;未進行基因敲除的動物模型在皮下注射DKK-1Ab，骨折橋接得到改善，這也提示了DKK-1Ab通過作用于β-連環蛋白信號傳導來增強骨修復[14～16]。另外，不論是重組DKK-1，還是DKK-1的腺病毒過表達，在小鼠骨折模型中都出現骨質愈合不良的反應[17]。在骨不連患者基質細胞中發現DKK-1處于高表達，表明DKK-1抑制Wnt信號通路傳導后可能導致骨折延遲愈合甚至骨不連[13]。這些研究表明抑制DKK-1表達，激活Wnt信號通路的傳導可以促進骨折修復，但DKK-1并不是在骨折所有階段都起到相同的作用。研究中發現為保持成骨細胞終末階段正常礦化，需要DKK-1和DKK-2上調[18]。過度激活Wnt/β-catenin后，小鼠的骨松質增加，但是骨的質量、剛度卻下降[12]。這可能由于Wnt/β-catenin被過度激活后導致成骨細胞終末分化受損，礦化水平降低及膠原的量、排列紊亂使成骨原料質量下降，最終骨的質量、剛度下降。因此，Wnt/β-catenin信號通路的作用可能是階段性的，DKK-1在骨折愈合過程（炎癥期、修復期及重塑期）中呈現出不同的效應。DKK-1和硬化蛋白（sclerostin）在骨折中起到協同作用，為此Florio等[16]在Scl-Ab和DKK-Ab的結構基礎上，設計出了靶向硬化蛋白和DKK-1的雙特異性抗體促進骨折的愈合。因此DKK-1在骨折過程中可能起到某種關鍵偶聯介質，單一調控DKK-1對骨折的影響可能有限，多種因子聯合調控可能是未來的研究方向。

2.3?DKK-1與股骨頭缺血壞死

股骨頭壞死（ONFH）分為創傷性與非創傷性，非創傷性主要以激素性與酒精性多見。骨髓間充質干細胞向成骨細胞和成脂細胞分化異常，一直是多數學者研究股骨頭壞死機制關注的領域。相關研究表明，激素性股骨頭壞死與DKK-1抑制Wnt信號通路傳導最終導致骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞和成脂細胞比例失調密切相關[19]。Kato等人[20]在激素性股骨頭壞死患者血清中檢測出DKK-1水平高于正常對照組，并證明了長期暴露于糖皮質激素的骨髓間充質干細胞的堿性磷酸酶活性較低，成骨分化能力以及骨再生能力下降，這些可能是高表達的DKK-1抑制Wnt信號通路所致。雖然酒精性股骨頭壞死與DKK-1的報道不多，但Ko等人[21]分別檢測16名激素性股骨頭壞死和18名酒精性股骨頭壞死患者的血清DKK-1豐度都顯著高于股骨頸骨折組，同時DKK-1在股骨頭壞死組織的骨細胞處于高表達狀態。國內的學者李偉峰等[22]發現股骨頭壞死患者血清DKK-1水平不僅與正常人有明顯差異，同時與患者病情的進展、嚴重程度有密切關系，作為實驗組的67例中有24例是酒精性股骨頭壞死。許多研究揭示了股骨頭壞死組織病理學中骨細胞死亡的高發生率，但是導致骨細胞凋亡的生物活性分子身份仍然不確定。敲除DKK-1消除了超生理糖皮質激素在動物模型中誘導的骨丟失和成骨細胞凋亡的作用，暗示DKK-1可能是一些骨骼疾病的致病因子。為此有學者提出設想，骨壞死中的骨細胞凋亡可能與DKK-1表達有關，并進行研究發現DKK-1與骨細胞中的促凋亡調節因子和程序性死亡調節因子的表達相關[23]。在股骨頭壞死過程中，DKK-1可能通過抑制Wnt通路，作為股骨頭壞死骨微觀結構惡化的細胞凋亡促進因子，從而促進病變中細胞凋亡活動。但是負責促進股骨頭中DKK-1表達的分子機制尚不清楚，缺血、氧化應激和機械負荷都可能是促進DKK-1表達的理化因素。

2.4?DKK-1與其他相關骨疾病

除了上文陳述的疾病之外，近些年文獻報道DKK-1可能是炎癥性關節炎中骨和關節病理改變的影響因素。與健康對照者相比，DKK-1在滑膜成纖維細胞表達增強，并且在類風濕性關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）患者的血清增加，部分研究也支持血清DKK-1水平升高可能與關節破壞和骨損傷有關[24～26]。與發生骨侵蝕的RA相比，強直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis，AS）患者血清DKK-1濃度高于健康對照組，但與骨化呈負相關，與疾病活動性并無明顯相關[27]。后續的研究發現DKK-1的下調可能導致成纖維細胞增殖和成骨增加，過表達導致相反的效果[28]。有人在膝關節骨性關節炎（Knee Osteoarthritis，KOA）的患者中發現膝關節滑液DKK-1水平高于健康對照組，并且結合影像表現發現DKK-1水平與KOA關節損傷的嚴重程度呈正相關，與RA、AS不同的是，KOA患者血清DKK-1水平與健康組相比，并未發現有明顯差異[29]。在諸如此類的炎癥性骨病中，DKK-1可能起到炎癥介質的作用。研究中發現，DKK-1抗體可預防骨質侵蝕，促進骨贅形成，然而并不影響炎癥;除此之外，在急性、慢性炎癥中DKK-1出現升高的現象[7，30]。DKK-1在慢性炎癥性疾病中介導骨侵蝕的潛在相關性已擴展到系統性紅斑狼瘡、銀屑病關節炎等疾病的研究[31～32]。盡管如此，DKK-1在這些疾病中的作用機制尚需要進一步研究。在炎性關節內抑制DKK-1活性導致最易受炎癥誘導骨侵蝕的部位形成骨贅，提示 DKK-1可能是炎癥與骨丟失偶聯的關鍵分子，而這與上文描述DKK-1在骨質疏松作用機制一致。

3?DKK-1Ab在骨丟失及骨修復的潛在作用

許多研究已經證實，使用DKK-1Ab抑制DKK-1的活性，可以減少骨量的丟失促進骨折的修復。給幼齡的卵巢切除（OVX）小鼠單次施用DKK-1Ab后，腰椎和下肢的骨密度（BMD）增加;此外，骨量少且雌激素缺乏的小鼠，每周用20 mg/kg的DKK-1Ab治療8周后，腰椎和股骨的BMD恢復到正常水平[33]。與性腺完整的幼鼠和雌激素缺乏小鼠結果不同的是，DKK-1Ab并未在骨質減少的成年OVX大鼠起到相似作用[34]。而這可能是DKK-1在成年大鼠和幼齡小鼠中表達的差異所致，最終導致DKK-1Ab在這些研究中出現功效差異。橫向脛骨骨折的模型小鼠用DKK-1Ab處理后，發現骨痂機械強度增加，機制可能是促進β-連環蛋白信號傳導，激活軟骨內骨化增強骨折修復[15]。雖然DKK-1Ab可以促進骨折的修復，但作用機制及作用時段尚未清楚。Komatsu等[35]報道在骨折后立即注射DKK-1Ab能夠促進骨折的修復，但在第4天注射并沒有明顯的效果，這提示DKK-1Ab促進骨折修復作用可能在骨折愈合的早期階段。Witcher等人[36]發現同時使用骨硬化蛋白抗體和DKK-1Ab產生的協同作用遠遠超過單一種抗體，且沉默骨硬化蛋白后，DKK-Ab具有高效骨合成代謝作用，對此他們得出的結論是DKK-1Ab通過阻止骨硬化蛋白上調增加骨量。在骨骼修復中，可能存在多種調節劑來限制骨形成。硬化蛋白和DKK-1可能通過阻斷LRP5/6與特異性Wnt結合，或者結合Wnt信號通路下游信號而具有某些冗余功能。而阻斷這兩種蛋白質可能進一步增加了Wnt信號傳導，從而對骨形成和修復產生更強大的作用。

4?展望

源于人類遺傳學觀察結果使人們對Wnt信號分子與骨形成之間的關系有了深刻的理解，并為骨骼疾病的新型合成代謝療法的發展開辟了一個激動人心的新時代。Wnt信號通路中的受體-配體、抑制劑-配體相互作用在骨代謝調節中的研究，為深入探討骨病發病機制以及骨修復尋求更好的合成代謝療法提供了機會。正如本文所述，DKK-1作為Wnt通路的抑制劑可能參與諸多疾病的發生發展，正成為合成代謝療法的主要新靶點。且單克隆抗體DKK-1Ab對DKK-1的抑制已經證明在骨疾病的各種動物模型中具有增加骨形成、骨量和骨強度的功效。但目前的文獻只是強調DKK-1Ab的短期效應;如果要將這些分子開發為長期臨床治療藥物，則需要更長時間的研究來證明這些分子的長期療效和安全性，包括骨質量和癌癥風險的評估。

參?考?文?獻

[1]Bafico A，Liu G，Yaniv A，et al.Novel mechanism of Wnt signalling inhibition mediated by Dickkopf-1 interaction with LRP6/Arrow[J].Nature Cell Biology，2001，3（7）：683-686.

[2]Tian E，Zhan F，Walker R，et al.The Role of the Wnt-Signaling Antagonist DKK1 in the Development of Osteolytic Lesions in Multiple Myeloma[J].New England Journal of Medicine，2003，349（26）：2483-2494.

[3]Ke HZ，Richards WG，Li X，et al.Sclerostin and Dickkopf-1 as therapeutic targets in bone diseases[J].Endocrine Reviews，2012，33（5）：747-783.

[4]Mao B，Wu W，Davidson G，et al.Kremen proteins are Dickkopf receptors that regulate Wnt/beta catenin signalling[J].Nature，2002，417（6889）：664-667.

[5]Guo X，Tang P，Liu P，et al.DKK1：A promising molecule to connect Alzheimer's disease and osteoporosis[J].Medical Hypotheses，2016，88：30-32.

[6]Tian J，Xu Xiao J，Shen L，et al.Association of Serum DKK-1 Levels with β-catenin in Patients with Postmenopausal Osteoporosis[J].Journal of Huazhong University of Science and Technology（Medical Sciences），2015，35（2）：212-218.

[7]Mazon M，Larouche V，St-Louis M，et al.Elevated blood levels of Dickkopf-1 are associated with acute infections[J].Immunity，inflammation and disease，2018，6（4）：428-434.

[8]Butler JS，Murray DW，Hurson CJ，et al.The role of DKK1 in bone mass regulation：Correlating serum DKK1 expression with bone mineral density[J].Journal of Orthopaedic Research，2011，29（3）：414-418.

[9]Coulson J，Bagley L，Barnouin Y，et al.Circulating levels of dickkopf-1，osteoprotegerin and sclerostin are higher in old compared with young men and women and positively associated with whole-body bone mineral density in older adults[J].Osteoporos Int，2017，28（9）：2683-2689.

[10]Voorzanger-Rousselot N，Journe F，Doriath V，et al.Assessment of circulating Dickkopf-1 with a new two-site immunoassay in healthy subjects and women with breast cancer and bone metastases[J].Calcified Tissue International，2009，84（5）：348-354.

[11]Hurson CJ，Butler JS，Keating DT，et al.Gene expression analysis in human osteoblasts exposed to dexamethasone identifies altered developmental pathways as putative drivers of osteoporosis[J].Bmc Musculoskeletal Disorders，2007，8：12.

[12]Chen Y，Whetstone HC，Lin AC，et al.Beta-catenin signaling plays a disparate role in different phases of fracture repair： implications for therapy to improve bone healing[J].Plos Medicine，2007，4（7）：e249.

[13]Bajada S，Marshall MJ，Wright KT.Decreased osteogenesis，increased cell senescence and elevated Dickkopf-1 secretion in human fracture non union stromal cells[J].Bone，2009，45（4）：726-735.

[14]Kim JB，Leucht P，Lam K，et al.Bone regeneration is regulated by wnt signaling[J].Journal of Bone & Mineral Research，2010，22（12）：1913-1923.

[15]Jin H，Wang B，Li J，et al.Anti-DKK1 antibody promotes bone fracture healing through activation of β-catenin signaling[J].Bone，2015，71：63-75.

[16]Florio M，Gunasekaran K，Stolina M，et al.A bispecific antibody targeting sclerostin and DKK-1 promotes bone mass accrual and fracture repair[J].Nature Communications，2016，7：11505.

[17]Minear S，Leucht P，Jiang J，et al.Wnt Proteins Promote Bone Regeneration[J].Science Translational Medicine，2010，2（29）：29-30.

[18]Lu C，Xing Z，Yu YY，et al.Recombinant human bone morphogenetic protein-7 enhances fracture healing in an ischemic environment[J].Journal of Orthopaedic Research，2010，28（5）：687-696.

[19]岳辰，張雪，溫陽陽，等.siRNA慢病毒載體介導DKK-1基因沉默對骨髓間充質干細胞分化影響的實驗研究[J].中華骨與關節外科雜志，2018，11（2）：137-142，150.

[20]Kato T，Khanh VC，Sato K，et al.Elevated expression of DKK-1 by glucocorticoid treatment impairs bone regenerative capacity of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells[J].Stem Cells & Development，2018，27（2）：85-99.

[21]Ko JY，Wang FS，Wang CJ，et al.Increased Dickkopf-1 expression accelerates bone cell apoptosis in femoral head osteonecrosis[J].Bone，2010，46（3）：584-591.

[22]李偉峰，陳立新，陳嘵俊，等.血清Dickkopf-1蛋白在早期診斷股骨頭壞死及病情監測中的意義[J].中國現代醫學雜志，2018，28（35）：43-47.

[23]Bruggink KA，Kuiperij HB，Gloerich J，et al.Dickkopf-related protein 3 is a potential Aβ-associated protein in Alzheimer's Disease[J].Journal of Neurochemistry，2015，134（6）：1152-1162.

[24]Santos AM，Saldarriaga EL，Giraldo-Bustos R，et al.Dickkopf 1 protein circulating levels as a possible biomarker of functional disability and chronic damage in patients with rheumatoid arthritis[J].Clinical Rheumatology，2017，37（3）：795-801.

[25]Seror R，Boudaoud S，Pavy S，et al.Increased Dickkopf-1 in Recent-onset Rheumatoid Arthritis is a New Biomarker of Structural Severity.Data from the ESPOIR Cohort[J].Scientific Reports，2016，6：18421.

[26]Passalent LA，Kang R，Lawson D，et al.THU0644-HPR E-Learning： An Effective Method To Improve Disease Knowledge and Self-Efficacy for Patients with Axial Spondyloarthritis[J].Annals of the Rheumatic Diseases，2016，75（Suppl 2）：1272.

[27]田麗貞，杜紅衛，童愛飛，等.DKK-1在強直性脊柱炎患者外周血中的表達及臨床意義研究[J].中國全科醫學，2017，20（z1）：131-133.

[28]Zou YC，Yang XW，Yuan SG，et al.Downregulation of dickkopf-1 enhances the proliferation and osteogenic potential of fibroblasts isolated from ankylosing spondylitis patients via the Wnt/β-catenin signaling pathway in vitro[J].Connective Tissue Research，2016，57（3）：200-211.

[29]Theologis T，Efstathopoulos N，Nikolaou V，et al.Erratum to： Association between serum and synovial fluid Dickkopf-1 levels with radiographic severity in primary knee osteoarthritis patients[J].Clinical Rheumatology，2017，36（8）：1933.

[30]Pinzone JJ，Hall BM，Thudi NK，et al.The role of Dickkopf-1 in bone development，homeostasis，and disease[J].Blood，2008，113（3）：517-525.

[31]Fassio A，Idolazzi L，Viapiana O，et al.In psoriatic arthritis DKK-1 and PTH are lower than in rheumatoid arthritis and healthy controls[J].Clinical Rheumatology，2017，36（10）：2377-2381.

[32]Mabille C，Witrand AR，Degboe Y，et al.DKK1 and sclerostin are early markers of relapse in multiple myeloma[J].Bone，2018，113：114-117.

[33]Glantschnig H，Scott K，Hampton R，et al.A Rate-Limiting Role for Dickkopf-1 in Bone Formation and the Remediation of Bone Loss in Mouse and Primate Models of Postmenopausal Osteoporosis by an Experimental Therapeutic Antibody[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2011，338（2）：568-578.

[34]Li XD，Grisanti M，Fan W，et al.Dickkopf-1 regulates bone formation in young growing rodents and upon traumatic injury[J].Journal of Bone & Mineral Research，2011，26（11）：2610-2621.

[35]Komatsu DE，Mary MN，Schroeder RJ，et al.Modulation of Wnt signaling influences fracture repair[J].Journal of Orthopaedic Research，2010，28（7）：928-936.

[36]Witcher PC，Miner SE，Horan DJ，et al.Sclerostin neutralization unleashes the osteoanabolic effects of DKK1 inhibition[J].JCI Insight，2018，3（11）：e98673.

（收稿日期：2019-05-27?修回日期：2019-06-22）

（編輯：潘明志）