氧化劑體外誘導對阿薩希毛孢子菌致病性影響的實驗研究

李海濤，區敏儀，敖俊紅，祝 賀，楊蓉婭

近30 多年以來，隨著糖皮質激素和免疫抑制劑的廣泛應用，以及惡性腫瘤、大面積燒傷、器官移植、血液病、艾滋病患者的日益增多，機會性真菌感染，特別是深部真菌感染的發病率呈顯著上升趨勢，已成為這些患者死亡的主要原因之一。除念珠菌病、曲霉病、隱球菌病等常見的真菌感染性疾病外，由非念珠菌屬酵母菌所致的真菌感染在免疫受損人群中日漸增多[1-4]，特別是深部播散性感染者病情嚴重，病死率高。阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）作為毛孢子菌屬中最重要的臨床致病菌，可引起淺表皮膚感染、播散性系統性內臟器官的感染以及夏季超敏性肺炎[5]，其引起的深部侵襲性感染病死率達70%以上，近年來該病發病率呈顯著上升趨勢[2,3]。

既往研究表明，病原微生物的抗宿主氧化殺傷與其致病性密切相關，這一點在釀酒酵母、念珠菌、煙曲霉、隱球菌等常見致病真菌的研究中已經得到證實[6-8]。但是，關于T.asahii抗氧化殺傷方面的研究還非常少。本研究擬通過體外誘導的方式，將2 種氧化劑與T.asahii作菌株體外共培養進行體外誘導，將誘導前后的T.asahii菌株注入到有聯合免疫缺陷的裸鼠體內，觀察T.asahii被氧化劑誘導前后對動物致病性的變化，為T.asahii感染與致病機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 實驗菌株 阿薩希毛孢子菌共2 株，T.asahii標準株CBS2479、環境株CBS8904 均購自荷蘭皇家藝術與科學學院真菌多樣性研究中心（CBS-KNAW）。

1.1.2 實驗動物及分組 Balb/c 裸鼠（聯合免疫缺陷鼠）168 只，雌性，6 周齡，平均質量30 g，購自北京大學醫學部實驗動物部，飼養于北京大學醫學部實驗動物部SPF 級動物室中。將小鼠分為7 組，CBS2479 組（菌株1）、CBS2479 H2O2誘導組（菌株2）、CBS2479 甲萘醌誘導組（菌株3），CBS8904 組（菌株4）、CBS8904 H2O2誘導組（菌株5）、CBS8904甲萘醌誘導組（菌株6），以及空白對照組（定為菌株7），每組24 只小鼠。再將每組分為4 個小組，每組6 只。

1.1.3 主要試劑與儀器 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）干粉（德國默克公司），蛋白胨干粉和葡萄糖干粉（北京化學試劑有限公司），酵母粉（英國OXOID 公司），30%過氧化氫（美國Sigma 公司），亞硫酸氫鈉甲萘醌（美國Sigma 公司），二酰胺（美國Sigma 公司），YPD 液體培養基（美國Gibco 公司）

1.2 實驗方法

1.2.1T.asahii菌株氧化劑體外誘導 制備經傳代純化的單克隆T.asahiiCBS2479、CBS8904 的菌懸液，調整濃度為1～5×106CFU/ml，取100 μl 菌懸液加入10 ml 不含H2O2的YPD 培養液中，37℃振蕩培養10 h 后加入H2O2，使其濃度達8 μg/ml（CBS2479、CBS8904 菌株的1/2MIC H2O2）后繼續培養，當培養菌液達到約0.5 麥氏單位時轉至同一H2O2濃度的培養液中培養，每個濃度梯度轉種2～3 次。以同樣方法進行下一濃度的培養，直至H2O2或甲萘醌的誘導濃度達到64 μg/ml 或者菌株被殺死不再生長，即終止誘導。將所得菌株以40%甘油保存于-80℃中。

1.2.2 各組T.asahii菌株菌懸液配制 將各組菌株傳代純化后的新鮮菌落接種于YPD 液體培養基中37℃生長48 h，取適量菌懸液，將YPD 培養基成分清洗干凈后，用生理鹽水分別配成濃度為1×105、1×106、1×107及1×108的菌懸液，分裝于2 ml 離心管中備用，空白對照組用生理鹽水替代菌懸液。

1.2.3 各組菌株致病性測定 取各組小鼠尾靜脈，常規消毒后，向其尾靜脈注入上述4 個梯度濃度的菌懸液500 μl，觀察并記錄30 d 內各組小鼠的死亡時間、死亡只數，繪制生存曲線圖，并用SPSS20.0 按Bliss法計算出半數致死量（median lethal dose，LD50）[9,10]。（LD50=lg-1[Xn-i(2∑m+h/2n-0.75)]，其中Xn 為最高反應組的對數劑量，i 為組距，即等差數列的對數劑量的公差，m 為各組動物反應數，∑m 各組動物反應數的總和，n 為每組動物數，h 為首末兩組動物數的平均數）比較它們的致病性差異。

1.3 統計學方法

應用SPSS20.0 軟件分析，兩組間比較采用配對樣本t檢驗和獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組T.asahii 菌株半數致死量測定結果

菌株1（CBS2479 組），即CBS2479 未誘導組的LD50為7.2361×105，而H2O2誘導后的菌株2（CBS 2479-H2O2誘導組）的LD50為6.0139×105，甲萘醌誘導后的菌株3（CBS2479-甲萘醌誘導組）的LD50為 8.1802×104，誘導后菌株的LD50濃度明顯低于誘導前，其中甲萘醌誘導組，即菌株3 的LD50濃度低于未誘導組——菌株1（CBS2479 組）1 個數量級（約10 倍），H2O2誘導組的LD50濃度則比未誘導組——菌株1 低了1.2 倍。菌株4（CBS8904 組），即CBS8904 未誘導組的LD50為8.9643×107，而H2O2誘導后的菌株5（CBS8904-H2O2誘導組）的LD50為4.0437×107，甲萘醌誘導后的菌株6（CBS8904-甲萘醌誘導組）的LD50為1.8971×106，誘導后菌株的LD50濃度也明顯低于誘導前。其中菌株6 的LD50濃度低于未誘導組——菌株4（CBS8904 組）1.5 個數量級（約47 倍），菌株5 的LD50濃度則比未誘導組——菌株4 低了2 倍（表1）。

2.2 各組小鼠生存率比較

氧化劑誘導后的臨床株菌株3（CBS2479-甲萘醌誘導組）和菌株2（CBS2479-H2O2誘導組）接種的小鼠分別在第9 天、第11 天全部死亡，生存率為0；而未誘導的菌株1（CBS2479 組）接種的小鼠在第9 天時有50%存活，生存率為50%，第11 天時生存率降低為10%，但是之后再沒有小鼠死亡。氧化劑誘導后的環境株菌株6（CBS8904-甲萘醌誘導組）和菌株5（CBS8904 -H2O2誘導組），接種的小鼠在第11 天的生存率分別20%和60%，而未誘導的菌株4（CBS8904組）接種的小鼠，在第6 天時生存率是70%，第6 天之后，一直到觀察終點（第30 天）所有小鼠均存活，沒有死亡。空白對照組所有小鼠在觀察期內全部存活，生存率為100%（圖1）。

3 討論

隨著廣譜抗生素、糖皮質激素的普遍使用，以及器官移植術、侵入性介入技術的普及，條件致病真菌感染的發生率呈逐年上升趨勢。病原體微生物（包括細菌、真菌和病毒等）侵入人體后，誘導人體進入氧化應激狀態。吞噬細胞是人體抵抗其感染的第一道防線，釋放大量活性氧遞質（reactive oxygen species，ROS）來殺滅病原體[11,12]。病原微生物為了生存，會啟動自身的一系列抗氧化機制，來對抗機體的氧化殺傷，為它們的侵襲感染和致病創造條件，因此，病原微生物的抗氧化機制與其致病性密切相關，這一點在釀酒酵母、念珠菌、煙曲霉、隱球菌等常見致病真菌的研究中已經得到證實[6-8]，但T.asahii在這一領域的研究還比較少。

Zong 等[13]研究發現，H2O2、甲萘醌、二酰胺可對T.asahii產生不同程度的氧化殺傷作用。Zhang等[14]也發現不同來源T.asahii的抗氧化酶過氧化氫酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性不同，提示T.asahii也具有抗氧化防御機制。區敏儀等[15]通過2 種氧化劑體外誘導的方式成功獲得了T.asahii體外抗氧化菌株，并對誘導前后菌株的藥物敏感性和生物學進行了研究，發現誘導后T.asahii的藥物敏感性明顯降低，MIC值顯著上升，菌株的肉眼形態和光鏡下形態均有明顯變化。

本研究主要通過體外誘導的方式獲得誘導前后T.asahii菌株，再將誘導前后的T.asahii菌株注射到聯合免疫缺陷鼠體內，觀察小鼠的死亡情況，對誘導前后T.asahii菌株的致病性進行評價。結果發現菌株1（CBS2479 組），即CBS2479 未誘導組的LD50為7.2361×105，而H2O2誘導后的菌株2（CBS2479-H2O2誘導組）的LD50為6.0139×105，甲萘醌誘導后的菌株3（CBS2479-甲萘醌誘導組）的LD50為 8.1802×104，誘導后菌株的LD50濃度明顯低于誘導前，其中甲萘醌誘導組，即菌株3 的LD50濃度低于未誘導組——菌株1（CBS2479 組）1 個數量級（約10 倍），H2O2誘導組的LD50濃度則比未誘導組——菌株1 低了1.2 倍。菌株4（CBS8904 組），即CBS8904 未誘導組的LD50為8.9643×107，而H2O2誘導后的菌株5（CBS8904 H2O2-誘導后組）的LD50 為 4.0437×107，甲萘醌誘導后的菌株6（CBS8904——甲萘醌誘導后組）的LD50為1.8971×106，誘導后菌株的LD50濃度也明顯低于誘導前。其中菌株6 的LD50濃度低于未誘導組——菌株4（CBS8904 組）1.5 個數量級（約47 倍），菌株5 的LD50濃度則比未誘導組——菌株4低了2 倍。研究結果提示，2 種氧化劑誘導后，無論是臨床株CBS2479，還是環境株CBS8904，其致病性均顯著上升，其中環境株CBS8904 受氧化劑誘導后，其致病性比臨床株CBS2479 升高的更明顯，但是環境株CBS8904 三組的整體LD50的濃度高于臨床株CBS2479 一個數量級，提示環境株CBS8904 經氧化劑誘導后，其致病性雖顯著升高，但是其致病能力仍低于臨床株CBS2479。分析原因可能為，CBS 8904 三組是體外氧化劑誘導組，只有氧化劑一個單一因素，氧化劑體外誘導，雖能模仿體內環境，但和機體內環境仍然有較大差異。而臨床株CBS2479 是從人體分離出來的致病菌，其與人體相互作用機制復雜，除了抗氧化機制之外，還有其他機制參與其中，不是單純的體外誘導能完全模擬的。

表1 各組T.asahii的半數致死量（LD50）比較

圖1 各組菌株動物致病性比較

本研究對接種至裸鼠的7 株菌致病性進行了觀察，結果發現，氧化劑誘導后的臨床株菌株3（CBS2479-甲萘醌誘導組）和菌株2（CBS2479-H2O2誘導組）的致病性顯著升高，兩組菌株接種后的小鼠分別在第9 天、第11 天全部死亡，生存率是0；而未誘導的菌株1（CBS2479 組）接種后的小鼠在第9天時有50%存活，生存率是50%，第11 天時生存率降低為10%，但是之后再無小鼠死亡。

氧化劑誘導后的環境株菌株6（CBS8904-甲萘醌誘導組）和菌株5（CBS8904 H2O2-誘導組）接種的小鼠在第11 天的生存率分別為20%和60%，而未誘導的菌株4（CBS8904 組）接種的小鼠在第6 天時生存率是70%，第6 天之后，一直到觀察終點（第30 天）所有小鼠均存活，沒有死亡。空白對照組所有小鼠在觀察期內全部存活，生存率為100%。從生存曲線圖可以看到，經氧化劑誘導后的菌株致病性明顯增強，小鼠生存率顯著降低。對2 種氧化劑誘導后的菌株致病性比較發現，甲萘醌誘導后T.asahii菌株，無論是臨床株，還是環境株，其致病性均高于相應H2O2誘導的菌株，而且氧化劑誘導后的T.asahii菌株，無論是甲萘醌誘導的，還是H2O2誘導的，臨床株（CBS2479）的致病性也高于環境株（CBS8904）。本課題組Zong 等[13]前期的研究也發現，H2O2、甲萘醌、二酰胺均可對T.asahii產生不同程度的氧化殺傷作用，但甲萘醌殺傷作用最強，二酰胺次之，H2O2最弱，說明甲萘醌的氧化殺傷作用要遠遠比H2O2強。因此，筆者分析，由甲萘醌體外誘導的T.asahii菌株的致病性要高于由H2O2體外誘導的T.asahii菌株，可能由于甲萘醌的氧化殺傷作用比H2O2更強，因而由它誘導出來的T.asahii菌株抗氧化能力則更強，但具體機制尚不清楚，需要進一步研究來闡明。

總之，本研究通過應用2 種氧化劑H2O2和甲萘醌在體外分別對T.asahii臨床株和環境株進行誘導，觀察誘導前后菌株的致病性，結果發現誘導后菌株致病性顯著高于誘導前，而甲萘醌誘導的菌株致病性高于H2O2誘導菌株，本研究從一個角度證明了T.asahii菌株對機體的感染或致病機制有抗氧化機制的參與，下一步將從組學的角度對T.asahii感染人體的抗氧劑機制進行深入研究。