內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在白癜風發(fā)病的研究進展

黃煜君，張峻嶺，劉曉潔

白癜風是一種常見的色素脫失癥，其特征在于表皮中的功能性黑素細胞和黑素的喪失，其中氧化應激產(chǎn)生的自身抗原和自身免疫性反應在白癜風的發(fā)病中起到重要的作用。各種因素引起白癜風黑素細胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過量以及ROS在黑素細胞中的積累，最終導致黑素細胞損傷和自身抗原的產(chǎn)生，其通過方式如下：①細胞凋亡；②由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導錯誤折疊的肽和細胞因子（如趨化因子）的積累及非折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）；③由鈣網(wǎng)蛋白觸發(fā)吞噬細胞的“吃我”信號[1]。誘導型熱休克蛋白70 的參與下，針對自身抗原的細胞免疫在黑素細胞破壞中占據(jù)重要位置，最終導致白癜風[2]，本文對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和趨化因子在白癜風發(fā)病機制中作用的研究進展進行綜述。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與白癜風

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是真核細胞內(nèi)的多層膜結(jié)構(gòu)細胞器，在細胞所需的復合物分子的合成中起主要作用[3]，在完成基本生理功能的同時，ER 憑借其龐大的膜結(jié)構(gòu)成為協(xié)調(diào)信號轉(zhuǎn)導的樞紐平臺。ER 為細胞內(nèi)Ca2+的主要儲存庫[4]，由于其蛋白質(zhì)折疊和轉(zhuǎn)運功能，ER 存在大量Ca2+依賴分子伴侶，如鈣網(wǎng)織蛋白等。ER 必須嚴格控制Ca2+水平，避免Ca2+失衡導致細胞死亡。遺傳或環(huán)境損傷會引起細胞內(nèi)缺氧、鈣穩(wěn)態(tài)失衡和分泌蛋白錯誤折疊或聚集，從而破環(huán)ER 功能，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS 時蛋白質(zhì)不能正確折疊積聚在ER 腔內(nèi)，細胞通過蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶-真核起始因子2α(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase-eukaryotic translationinitiation factor 2α，PERK-e IF2α）、肌醇需求酶1-X盒子結(jié)合蛋白（inositol-requiring enzyme 1a-X-boxbinding protein1，IRE1-XBP1）和轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）一系列信號網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)導途徑，提高蛋白質(zhì)正確折疊能力、抑制蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和積聚、加速非功能性和隱含毒性蛋白降解，引發(fā)內(nèi)ERS 相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和加強ER 的自我修復能力，這些反應統(tǒng)稱為UPR。ERS 過強或持續(xù)時間過久，UPR 不足以恢復ER 穩(wěn)態(tài)，則最終引起細胞凋亡。ERS 的表現(xiàn)包括UPR、ER 相關(guān)性死亡和整合應激反應這3 個交互相聯(lián)的動態(tài)過程[5]。綜上所述，ERS 是ER 腔內(nèi)錯誤折疊蛋白聚集形成的一種適應性反應，一方面UPR 被激活來抵御外界刺激所造成的有害影響，另一方面當 UPR 不足以重新構(gòu)建ER穩(wěn)態(tài)時，UPR 通路將誘導細胞凋亡信號而引起細胞凋亡。

相關(guān)研究表明，白癜風患者黑素細胞ER 有未折疊蛋白沉積，故推斷ERS 為白癜風發(fā)病機制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。2000 年，Le Poole 等[6]用逆轉(zhuǎn)錄病毒將人乳頭瘤病毒（HPV）16 型的E6 和 E7 基因轉(zhuǎn)染到白癜風患者黑素細胞系 Ma9308P4，組合成人永生白癜風黑素細胞系 PIG3V，并成功表達出酪氨酸酶，在PIG3V 細胞中發(fā)現(xiàn)了擴張的ER，并在ER 中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子，初步證明ER 的擴張可能是蛋白質(zhì)滯留引起。當ER 發(fā)生應激時，非折疊或錯誤折疊的多肽及沒有組裝好的蛋白將滯留在ER 腔，ERS 早期通過誘導UPR，使蛋白質(zhì)的生物合成減少，降低ER 負擔。隨著 ERS 加劇，UPR 的激活被抑制，引起 ER攝取或釋放 Ca2+障礙或蛋白質(zhì)加工或運輸障礙，細胞就會由生存向凋亡轉(zhuǎn)換。此外，酪氨酸酶的轉(zhuǎn)運障礙也可為ERS 參與白癜風發(fā)病的證據(jù)之一。Guan等[7]發(fā)現(xiàn)中國人群白癜風易感基因為VIT-1/FBXO11，沉默該基因可影響黑素細胞的超微結(jié)構(gòu)。該研究表明InnVit基因被抑制后直接影響黑素細胞ER 的形態(tài)，酪氨酸酶表達量異常增加，并滯留于ER，提示酪氨酸酶非常態(tài)增多是蛋白酶體降解途徑發(fā)生障礙導致的。

1.2 ERS的3種信號通路

真核細胞產(chǎn)生ERS 時，UPR 激活其典型3 種信號通路，這些信號通路根據(jù)其在ER 上發(fā)起效應器的不同分為蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PKR like ER kinase，PERK）、1 型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)膜蛋白激酶（type-1ER transmembrane protein kinase，IRE1）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）3 類。在正常生理狀態(tài)下，ER 腔區(qū)域的3 個跨膜受體蛋白PERK、IRE1 和ATF6 與GRP78/ Bi P 處于結(jié)合狀態(tài)，形成穩(wěn)定復合物，使它們處于未激活狀態(tài)。當細胞ER 中蛋白質(zhì)折疊紊亂，積累大量未折疊或錯誤折疊蛋白時，RP78/Bi P 作為ER 穩(wěn)態(tài)感受器，與3 種UPR 效應器PERK、IRE1 和ATF6 解離，轉(zhuǎn)而結(jié)合新生的未折疊蛋白，而被激活游離的3 種跨膜感受蛋白則激發(fā)UPR 信號級聯(lián)反應[8,9]。

近期研究表明，UPR 信號通路參與了白癜風的發(fā)病機制。Spritz[10]發(fā)現(xiàn)編碼XBP1 的基因可調(diào)節(jié)下游UPR 靶標的轉(zhuǎn)錄因子，與白癜風發(fā)病風險增加相關(guān)。Toosi 等[11]通過使用4-叔丁基苯酚和對苯二酚單芐基醚（已知的白癜風誘發(fā)劑）建立白癜風人體黑素細胞ERS 模型，結(jié)果顯示黑素細胞暴露于這些化學物質(zhì)可以激活UPR 并導致抗氧化反應的增強，并監(jiān)測到PERK 及其下游靶標ATF4 的表達增加及EIF2α 磷酸化的增加。此外，在誘導劑給藥后3 h 可檢測到黑素細胞IRE1 的表達和磷酸化增加，并伴隨XBP1 的剪接增加。

1.3 ERS相關(guān)蛋白

1.3.1 鈣網(wǎng)織蛋白 鈣網(wǎng)織蛋白（calreticulin，CRT），一種調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+的無處不在的ER 蛋白，定位于單核細胞、巨噬細胞等表面，介導抗原提呈，補體活化和凋亡細胞。對白癜風的研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應激下，CRT 從ER 腔再分布到黑素細胞表面。然后表面CRT 可以指導ROS 應激黑素細胞接觸樹突狀細胞（dendritic cells，DCs），然后激活下游免疫反應導致凋亡。CRT 的過表達增加黑素細胞對DC 誘導的免疫原性細胞凋亡的易感性[12]。此外，CRT 表達與白癜風持續(xù)時間和病變面積呈正相關(guān)[13]。CRT 介導的黑素細胞破壞可以誘導針對在氧化應激下的凋亡黑素細胞的免疫應答。

宋璞[14]研究發(fā)現(xiàn)，通過體外構(gòu)建過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導的黑素細胞及角質(zhì)形成細胞氧化應激模型，觀察氧化應激狀態(tài)下CRT、C1q 受體球狀結(jié)構(gòu)域（receptor for the C1q global domain，gC1qR）及CRT/gC1qR 復合體在黑素細胞及角質(zhì)形成細胞應對氧化損傷的作用及分子機制，得出以下結(jié)論：①證實CRT 可增強黑素細胞免疫源性，通過DC 為主的抗原提成作用啟動了CD8+T 淋巴細胞為主的特異性免疫反應。②持續(xù)的氧化應激誘導黑素細胞ER 及線粒體應激，CRT 膜外聚集，gC1qR進入細胞線粒體內(nèi)蓄積，二者共同促進線粒體功能障礙，細胞凋亡；而在角質(zhì)形成細胞中，gC1qR 與CRT 形成CRT/gC1qR 復合體則可阻止gC1qR 線粒體和核轉(zhuǎn)位,促進細胞增殖或遷移。氧化應激可影響CRT、gC1qR 蛋白表達和亞細胞定位。

1.3.2 硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白5 硫氧還原蛋白是一類在體內(nèi)廣泛表達的蛋白，可參與調(diào)控氧化還原反應。硫氧還原蛋白結(jié)構(gòu)域5（thioredoxin domaincontaining protein 5，TXNDC5）屬于其家族一員，在ER 中具有蛋白折疊和分子伴侶活性，其表達失調(diào)與氧化應激、細胞衰老以及關(guān)節(jié)炎、癌癥、糖尿病、白癜風等的發(fā)病機制有關(guān)，這使得TXNDC5 成為易感生物標志物以及潛在的藥理學靶點[15]。

7 個多態(tài)性已經(jīng)與非節(jié)段性白癜風（nonsegmental vitiligo，NSV）相關(guān)聯(lián)。單核苷酸多態(tài)性（seven single nucleotide polymorphisms，SNPs）代表人類基因組中最常見的遺傳變異。多項研究表明TXNDC5基因中含有大量SNP。與病理有關(guān)的所有SNP 位于DNA 的非編碼區(qū)（內(nèi)含子，5'-UTR 和3'-UTR）。這些區(qū)域在TXNDC5的基因表達和調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用。NSV 是一種被認為涉及TXNDC5 的多基因疾病[16]。ROS 可能是造成黑素細胞損傷的原因之一，也是蛋白質(zhì)錯誤折疊的原因之一。根據(jù)這個假說，壓力細胞不會死亡并且繼續(xù)產(chǎn)生錯誤折疊的蛋白質(zhì)，最終可能導致白癜風的發(fā)生[17]。

2 ERS與趨化因子

2.1 趨化因子與白癜風

趨化因子于1987 年首次被發(fā)現(xiàn)，是一類小分子蛋白家族，因具有趨化和激活白細胞的功能而被命名。人體內(nèi)含有約50 種趨化因子，趨化因子通過激活細胞膜表面7 次跨膜的G 蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮作用，這類受體稱為趨化因子受體[18]。為初步探討白癜風與趨化因子相關(guān)性，楊玲玲[19]采用Lummex 技術(shù)檢測160 例白癜風患者和40 例健康對照組外周血血清中趨化因子含量，分析各種趨化因子與白癜風關(guān)系，結(jié)果顯示，進展期患者血清C-X-C 型趨化因子7（C-X-C motifchemokines 7，CXCL7）、CXCL8、CXCL11、C-C 型趨化因子2（C-C motif chemokine 2，CCL2）、CCL4、CCL5、CCL22 水平較穩(wěn)定期患者明顯升高；尋常性白癜風患者血清CXCL8、CCL3水平較節(jié)段型顯著升高，血清CCL3 水平與白斑總面積呈顯著相關(guān)性；血清CXCL10 水平與年齡呈正相關(guān)。故趨化因子CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL10、CXCL11、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL22 在白癜風發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

有研究發(fā)現(xiàn)病灶活動邊界吸皰液中的CXCL9濃度是進展期白癜風的良好生物標志物，其敏感性為100%，特異性為93%。免疫組化研究也證實，CXCL9 在白癜風皮膚中的表達與疾病狀態(tài)明顯相關(guān)。同樣，與穩(wěn)定期的患者相比，進展期白癜風患者的皮損中CXCL10 mRNA 增加[20]。

相關(guān)研究提示，CXCL10 已成為白癜風的一種活性標志。CXCL10 是一種在干擾素（IFN）-γ 作用下產(chǎn)生的趨化因子，與其存在于誘導T 淋巴細胞歸巢的淋巴細胞上的受體CXCR-3 結(jié)合，導致其吸引IFN-γ 產(chǎn)生病變和持續(xù)正循環(huán)。Abdallah 等[21]通過多中心臨床實驗，以免疫組化和血清學研究55 例NSV患者及對照組，結(jié)果與發(fā)現(xiàn)所有NSV 患者血清白細胞介素（IL）-6，CXCL-10 和IL-17 水平較對照組明顯升高，且活動期和穩(wěn)定期NSV 患者血清IFN-γ，IL-6，CXCL-10 和IL-17 水平顯著升高。

CXCL16 在角質(zhì)形成細胞中組成型表達，最近發(fā)現(xiàn)可介導人皮膚中CD8+T 淋巴細胞的歸巢。Li 等[22]在暴露于H2O2的角質(zhì)形成細胞中檢測產(chǎn)生的趨化因子，并監(jiān)測CXCL16-CXCR6 介導白癜風患者CD8+T 淋巴細胞的趨化性遷移。結(jié)果顯示CXCL16 表達增加，與白癜風患者血清和病變氧化應激水平呈正相關(guān)。角質(zhì)形成細胞內(nèi)可觀察誘導的CXCR6+CD8+T淋巴細胞的遷移。CXCR6+CD8+T 淋巴細胞浸潤的白癜風患者皮損中黑素細胞明顯減少。由此可以得出，CXCL16-CXCR6 在白癜風患者的氧化應激下介導CD8+T 淋巴細胞運輸。

2.2 氧化應激與趨化因子

在白癜風患者的表皮中發(fā)現(xiàn)ROS 水平增加，ROS 可以導致抗氧化系統(tǒng)、黑素合成相關(guān)蛋白和黑素細胞膜脂質(zhì)的各種改變，導致體內(nèi)平衡紊亂和細胞生存障礙。此外，應激的黑素細胞發(fā)生凋亡，還可以分泌含有黑素細胞特異性抗原和免疫刺激信號的外來體，啟動對黑素細胞的自身免疫反應，從而導致疾病進展。除黑素細胞外，角質(zhì)形成細胞還可以被表皮中的氧化應激所擊中。van den Boorn 等[23]通過建立皮膚外植體模型研究提示，白癜風患者CD8+T 淋巴細胞可浸潤自體正常皮膚外植體并殺死黑素細胞，表明CD8+T 淋巴細胞參與疾病進展。然而，在ERS過程中，CD8+T 淋巴細胞是如何遷移到白癜風患者的病變中的還未完全清楚。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾種趨化因子是導致CD8+T 淋巴細胞皮損內(nèi)轉(zhuǎn)移的原因。轉(zhuǎn)基因小鼠白癜風模型的研究表明，CD8+T 淋巴細胞在皮膚的積累主要取決于CXCR3，IFN-γ-CXCL10-CXCR3 軸對表皮色素脫失的進展和維持起著關(guān)鍵效應。最近，一個新的趨化因子對CXCL16-CXCR6 的相互作用已經(jīng)被報道認為介導人皮膚中CD8+T 淋巴細胞的歸巢。Li 等[22]為確定白癜風組織中趨化因子產(chǎn)生是否是由ERS 引起的，故平行檢測了H2O2水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有分析的趨化因子中，CXCL16 和CXCL10 表達與H2O2的累積呈正相關(guān)。

2.3 信號通路PERK-eIF2α與趨化因子

為了深入了解PERK -eIF2α 途徑介導的CXCL16表達的機制，研究者在JASPAR 數(shù)據(jù)庫中篩選了候選轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)CXCL16 啟動子的-2000 至+1 區(qū)域具有預測轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65（為一個轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族的其中1 個亞單位）的結(jié)合位點。這是在ER 應激下由PERK介導的eIF2α磷酸化所激活的靶向因子。與此相同條件下，H2O2誘導的NF-κBp65 磷酸化可被HaCaT 細胞中的PERK 或eIF2α 的敲除所抑制。此外，敲除NF-κBp65 減弱了H2O2誘導的CXCL16蛋白表達。染色質(zhì)免疫沉淀分析證實CXCL16 啟動子的-149 至-388 片段是NF-κBp65 的結(jié)合位點。這些數(shù)據(jù)表明，UPR 的PERK-eIF2α 臂激活NF-κBp65參與人角質(zhì)形成細胞中H2O2誘導的CXCL16 產(chǎn)生。

2.4 信號通路IRE1α-XBP1與趨化因子

除PERK 外，IRE1α-XBP1 是UPR 的另一個重要途徑。UPR 的IRE1α-XBP1 分支的激活也在應激角質(zhì)形成細胞中的CXCL16 表達中起重要作用。最新實驗檢測了IRE1α-XBP1 在人角質(zhì)形成細胞中通過ROS 誘導CXCL16 的參與反應。在H2O2處理6 h 后IRE1α 的磷酸化顯著增加，伴隨著XBP1 剪接的增加。免疫熒光顯示經(jīng)H2O2處理的HaCaT 細胞中磷酸化的IRE1α的核分數(shù)和剪接的XBP1 增高，并且發(fā)現(xiàn)磷酸化的IRE1α 信號的比率（核/細胞質(zhì)）增加，表明在白癜風患者中磷酸化的IRE1α 易出現(xiàn)位置更高的核易位。

3 結(jié)語

大量研究已經(jīng)確定氧化應激是自身免疫啟動的關(guān)鍵因素。白癜風是一種自身免疫性疾病，綜上所述，ERS 及趨化因子在白癜風發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用，越來越多的證據(jù)表明二者相互作用，協(xié)同形成相關(guān)作用信號，參與黑素細胞破壞。受損的角質(zhì)形成細胞對氧化應激反應的CXCL16 表達增加在白癜風患者的CD8+T 淋巴細胞皮膚遷移中起關(guān)鍵作用。因此，針對UPR-CXCL16-CXCR6 軸可能為白癜風的治療開辟新的方向。由ROS 誘導的角質(zhì)形成細胞中的CXCL16表達至少部分通過2 種UPR 途徑發(fā)生：PERK-eIF2α和IRE1α-XBP1。阻 斷CXCL16-CXCR6 相互作用減輕CD8+T 淋巴細胞遷移，表明靶向ROS-CXCL16-CXCR6 軸可能是白癜風的有效治療選擇。