LDH-A和LDH-B在皮膚鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

楊成蓮，段鱈蕓，鐘桂書

腫瘤細胞是一群異常增殖的細胞，與正常細胞的能量供應方式不同，其糖代謝的特征性改變是有氧糖酵解，即Warburg 效應[1]。隨著研究的深入，發現腫瘤細胞間存在代謝共生[2]。腫瘤細胞生長迅速、血管生成不足使得腫瘤內存在乏氧區與富氧區。乏氧區腫瘤細胞以糖酵解方式供能為主，將丙酮酸生成乳酸。而富氧區主要采用氧化磷酸化方式產能，通過乳酸穿梭機制利用乏氧區產生的乳酸，將乳酸轉化為丙酮酸再進入三羧酸循環產生三磷酸腺苷（ATP）。乳酸脫氫酶（LDH）由A、B 亞基(LDH-A、LDH-B)構成的四聚體酶，它是糖酵解過程中丙酮酸與乳酸相互轉化的關鍵酶，也是丙酮酸生成之后惟一的酶。丙酮酸是進入糖酵解途徑還是三羧酸循環，與LDH的活性有關[3]，因此LDH 成為腫瘤代謝研究的關鍵點。當組織發生惡變時，LDH 與腫瘤的增生、侵襲呈明顯相關性，目前已在乳腺癌等多種腫瘤中檢測到LDH 的活性明顯升高，且在不同的腫瘤中LDH-A和LDH-B 的表達存在差異[4]。本研究旨在通過檢測LDH-A、LDH-B 在皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC）組織中的表達水平，探討LDH-A、LDH-B 在CSCC 進展中發揮的作用，為其進一步研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 收集西南醫科大學附屬醫院皮膚科2013 年01 月—2017 年12 月確診的CSCC 88 例，男42 例,女46 例，年齡42～93 歲，平均年齡（62.55±14.11）歲,病程1 個月～30 年，平均病程（31.74±4.10）個月，均無淋巴結轉移。按世界衛生組織（WHO）分類標準將CSCC 劃分為Ⅰ～Ⅳ級，Ⅰ～Ⅱ級為高分化CSCC（40 例），Ⅲ～Ⅳ級為低分化CSCC（48 例）。腫瘤部位：頭面部70 例，四肢8 例，頸部6 例，胸腹部4 例。所有石蠟標本均經組織病理檢查明確診斷，所有患者為首次就診，術前未接受過放化療、光動力治療及其他特殊治療，且未并發內臟腫瘤。取該院外科手術切除的正常皮膚組織40 例作為對照組，男20 例，女20 例，年齡22～72 歲，平均年齡（64.18±13.02）歲，其中頭面部32 例，四肢4 例，頸部2 例，胸腹部2 例。

1.1.2 試劑 鼠抗人LDH-A 多克隆抗體、鼠抗人LDH-B 多克隆抗體（美國Santa Cruz 公司），MaxVisionTMHRP 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發公司）。LDH-A 抗體工作液濃度為1:100，LDH-B 抗體工作液濃度為1:200。

1.2 方法

石蠟標本3 μl 連續切片，經脫蠟、水化、檸檬酸鹽高壓煮沸法修復抗原、3%H2O2阻斷內源性過氧化物、抗體孵育。采用免疫組化Maxvision 法，具體操作參照試劑盒說明書。DAB 顯色、蘇木精復染。免疫組化染色陽性對照為已確定為陽性表達的乳腺癌組織切片，PBS 代替一抗為陰性對照。

1.3 結果判定標準

LDH-A、LDH-B 均以胞質或胞核內出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。由2 位以上的有經驗的病理科醫師對切片進行隨機觀察。每個標本選取免疫染色豐富區域，在400 放大倍數下隨機選取5 個視野，按一定順序計數200個腫瘤細胞，并對其進行著色強度和比例評分：基本無著色記0 分，淺棕黃色記1 分，棕黃色記2 分，棕褐色記3 分。著色細胞占計數細胞百分率＜10%記1 分，10%～50% 記2 分，50%～80%記3 分，＞80%記4 分。以上兩項評分相加：0～2 分或著色細胞數＜10%為（-），3 分 為（+），4～5 分 為（++），6～7 分為（+++）。

1.4 統計學方法

采用SPSS17.0 統計軟件進行統計學分析，采用χ2檢驗分析CSCC 組與對照組之間陽性表達率，采用等級資料的秩和檢驗分析腫瘤分級與陽性表達程度的差異，采用Spearman 相關性檢驗分析兩樣本相關性。以α=0.05 為檢驗標準，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LDH-A、LDH-B 在CSCC、正常皮膚組織中的表達

LDH-A、LDH-B 蛋白陽性產物主要定位于胞質，呈棕黃色顆粒。正常皮膚組織的基底層和附屬器細胞質僅少量表達LDH-A 和LDH-B，呈淺棕黃色顆粒。CSCC 細胞質可見LDH-A、LDH-B 呈現不同程度表達（圖1，圖2），且明顯高于正常皮膚組織，差異有統計學意義（χ2LDH-A=35.939，χ2LDH-B=31.709，P＜0.05）。LDH-A、LDH-B 在CSCC 中的表達在患者性別、年齡、病程、腫瘤大小、部位、數目上的差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 LDH-A、LDH-B在CSCC組織和正常皮膚組織中的表達 [例(%)]

圖1 LDH-A在正常皮膚組織和CSCC中的表達（MaxVision法×200）

圖2 LDH-B在正常皮膚組織和CSCC中的表達（MaxVision法×200）

2.2 高分化與低分化CSCC 組織中LDH-A、LDH-B蛋白的表達情況

LDH-A 在低分化CSCC 組織中的陽性表達更高，差異有統計學意義（χ2=11.641，P＜0.05）。而LDH-B 在高分化CSCC 組織中的陽性表達更高，差異有統計學意義（χ2=15.387，P＜0.05），見表2，表3。

表2 高分化與低分化CSCC組織中LDH-A的表達 [例(%)]

表3 高分化與低分化CSCC組織中LDH-B的表達 [例(%)]

2.3 LDH-A 和LDH-B 蛋白表達的相關性分析

經Spearman 等級相關分析表明，CSCC 組織中LDH-A 和LDH-B 蛋白表達并無相關性（r=0.079，P＞0.05），見表4。

表4 CSCC組織中LDH-A和LDH-B表達的相關性 [例(%)]

3 討論

腫瘤細胞的代謝特征之一就是有氧糖酵解，一分子葡萄糖雖然只能產生兩分子ATP，但效率極高。高度惡性的腫瘤細胞其糖代謝率可達正常細胞200倍以上，因此腫瘤組織內能產生與正常組織相當的ATP 的量[5]。目前有氧糖酵解的機制尚未闡明，可能與Ras 和c-Myc 等癌基因激活或抑癌基因失活等多靶點調控有關，通過直接上調并激活糖酵解相關酶和抑制三羧酸循環通路中的酶，包括上調編碼LDH 的基因表達和蛋白修飾[6]。另一方面，乳酸作為糖酵解的產物在維持腫瘤能量供應，誘導腫瘤干細胞生成、血管形成，促進腫瘤增生和侵襲也起重要作用。同時研究發現腫瘤細胞間以及腫瘤細胞與周圍間質細胞間均存在乳酸穿梭機制[7,8]。乳酸可能是比葡萄糖更重要的能量運載體[9]，因此LDH 受到進一步關注。

LDH-A、LDH-B 由不同基因編碼，分別定位于11 號和12 號染色體。A 亞基主要催化丙酮酸生成乳酸，B 亞基則促進乳酸向丙酮酸轉化。兩種亞基按不同比例組成LDH1～LDH5 5 種同工酶。研究表明，LDH-A 在惡性黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、大腸癌等多種惡性腫瘤中表達上調,并與腫瘤大小、惡性程度呈正相關[10]。抑制LDH-A 基因表達，能抑制乳腺癌的糖酵解，明顯降低腫瘤生長和轉移能力，可能與腫瘤PI3K-AKT-mTOR 信號通路激活有關，激活的mTOR 促進低氧誘導因子（HIF-1a）表達，HIF-1a 表達增強能上調LDH-A 表達，下調LDH-B表達，進而促進糖酵解進行[11]。目前有關LDH-B 的研究發現，在肺癌、髓母細胞瘤中已檢測到高表達的LDH-B,但在呈現高度惡性的前列腺癌及肝癌細胞中卻少量表達，可能與LDH-B 基因啟動子的甲基化有關[12,13]。

本實驗結果顯示，LDH-A、LDH-B 在CSCC中的表達明顯高于正常皮膚組織，可能與腫瘤高度活躍的糖代謝有關。此外，低分化的CSCC 組織中LDH-A 的表達明顯高于高分化組織，提示升高的LDH-A 水平與CSCC 的惡性程度有關。相比之下，低分化的CSCC 惡性程度更高，增生速度更快，易造成血管生成不足。出現局部氧供、葡萄糖供應不足。腫瘤細胞為適應組織內的低氧微環境，LDH-A 基因轉錄能被HIF-1a 增強，傾向于糖酵解方式供能，加速葡萄糖轉變為乳酸[14]。相反，高分化的CSCC 組織中能檢測到更高的LDH-B 表達，可能由于LDH-B能催化乳酸的再利用及促進有氧氧化的進行。有趣的是CSCC 組織中LDH-A 和LDH-B 表達并無相關性。考慮與腫瘤組織中代謝是動態變化的過程，受到血供、氧供等腫瘤微環境影響，而A、B 亞基的基因轉錄、翻譯和修飾過程受到多基因及信號通路調控等有關。有研究表明，CSCC 腫瘤面積＞2 cm2者轉移率、復發率增高[15]，但本實驗結果中并未發現LDH-A 表達水平與腫瘤大小相關，這可能與CSCC 相較于惡性黑素瘤等腫瘤惡性程度低。本研究所選標本尚無淋巴結及全身轉移，隨后可以擴大樣本量及對轉移灶進行深入研究。

Liu 等[16]對前列腺癌患者長達15 年的隨訪發現，癌組織中高LDH-A 水平和低LDH-B 水平的患者臨床預后更差。因此，LDH-A 和LDH-B 的表達對評價CSCC 的發展有重要的臨床價值，二者在CSCC 中的作用及調控的機制還需進一步闡明。