還原型谷胱甘肽對膿毒癥大鼠心肌組織中Toll樣受體4表達的影響

陳斌 童朝陽 施東偉

(復旦大學附屬中山醫(yī)院急診科，上海 200032)

膿毒癥是臨床常見的危重病癥，嚴重膿毒癥常可導致多器官功能衰竭綜合征(multiple organ distress syndrome，MODS)。國內(nèi)外均有臨床研究[1-2]表明，心肌損傷是嚴重膿毒癥時最常見的并發(fā)癥之一，是膿毒癥患者預后不良的重要原因。然而，目前有關膿毒癥致心肌損傷的機制及干預方法的研究尚不多見。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術(cecal ligation and puncture，CLP)建立大鼠膿毒癥模型，然后早期應用還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)進行干預治療，觀察GSH對大鼠血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB)水平和心肌組織Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)mRNA表達的影響，旨在探討GSH對膿毒癥致急性心肌損傷的保護作用及其作用機制。

1 資料與方法

1.1 主要儀器和試劑 自動生化分析儀(VITROS 950，美國強生公司)；高速冷凍離心機(Centrifuge 5417R，德國Eppendorf公司)；實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(real-time fluorescence reverse transcription-polymerase chain reaction，PCR)儀(Illumina Eco，美國Illumina公司)；752型紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)；GSH(阿拓莫蘭，重慶藥友制藥有限責任公司，批號：0909020)；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、RNA酶抑制劑均購自美國Invitrogen公司；所有引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2 實驗動物及分組 清潔級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，由復旦大學醫(yī)學院動物房提供，體質(zhì)量200～250 g。按照隨機數(shù)字表將大鼠隨機分為4組。正常組(Normal組，n=6)：不行CLP術且未注射藥物；假手術組(Sham組，n=18)：僅行剖腹手術，不行CLP術，術后尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液0.1 mL；膿毒癥組(CLP組，n=18)：行CLP術，術后尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液0.1 mL；GSH干預組(GSH+CLP組，n=18)：行CLP術，術后尾靜脈注射GSH(60 mg/kg)0.1 mL。除正常組外每組大鼠再按術后6 h、12 h、24 h分為3個亞組(n=6)，在各個時間點采集血清及大鼠心臟組織標本，所有大鼠均于血標本采集完畢后處死。在各個時間點之前死亡的大鼠被排除在研究之外。

1.3 膿毒癥模型的制作 采用CLP術制作大鼠膿毒癥模型。大鼠手術前晚禁食不禁水，采用3%戊巴比妥鈉(40～50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，于腹正中線行1.5～2.0 cm的縱行切口，充分暴露盲腸，在盲腸末端距離回盲瓣約5 mm處結(jié)扎，但不能影響腸道的通暢性。然后用18號針頭行盲腸穿刺2次，輕輕擠壓盲腸，使少量盲腸內(nèi)容物溢出。原位回納盲腸，逐層縫合關腹。各組術后均按50 mL/kg(體質(zhì)量)皮下注射0.9%氯化鈉溶液來補充液體流失。各亞組大鼠分別在相應時間點采用頸動脈置管抽血后處死，收集心臟組織標本待測。

1.4 標本檢測 取血清標本1 mL，采用自動生化分析儀測定血清CK-MB水平；取部分心臟組織標本，采用RT-PCR法檢測心肌組織中TLR4的mRNA表達；取另一部分心臟組織標本，置入10%中性甲醛溶液中固定8 h以上，然后石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察病理組織學改變。

2 結(jié) 果

2.1 CLP術及GSH對大鼠血清CK-MB的影響 Sham組和Normal組術后6 h、12 h、24 h血清CK-MB水平組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Sham組及Normal組比較，CLP組術后6 h血清CK-MB水平開始升高，12 h達到高峰，24 h仍明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與CLP組比較，GSH+CLP組大鼠術后6 h血清CK-MB水平有所下降，術后12 h、24 h血清CK-MB水平較CLP組明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 CLP術及GSH對大鼠心肌組織中TLR4 mRNA表達的影響 Sham組與Normal組大鼠術后6 h、12 h、24 h心肌組織中TLR4 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Sham組及Normal組比較，CLP組術后6 h心肌組織中TLR4 mRNA表達開始升高，12 h達到高峰，24 h仍明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與CLP組比較，GSH+CLP組大鼠術后6 h心肌組織中TLR4 mRNA表達有所下降，術后12 h、24 h心肌組織中TLR4 mRNA表達較CLP組有明顯的下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 組織病理學結(jié)果 Normal組和Sham組大鼠術后24 h心肌組織肌纖維結(jié)構排列緊密，無充血水腫，未見明顯異常改變；CLP組術后24 h心肌病理檢查可見肌纖維結(jié)構排列疏松紊亂，間質(zhì)充血水腫，大量炎性反應細胞浸潤，心肌細胞腫脹，可見空泡狀變性等改變；GSH+CLP組大鼠術后24 h心肌組織上述病理學損傷性改變均顯著輕于CLP組。見圖1。

表1 各組大鼠術后不同時間點血清CK-MB水平的變化

表2 各組大鼠術后不同時間點心肌組織TLR4 mRNA相對表達量的變化

A：Normal組；B：Sham組；C：CLP組；D：GSH+CLP組

3 討 論

膿毒癥的本質(zhì)是全身炎性反應綜合征(syste-mic inflammatory response syndrome，SIRS)。免疫調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物Toll樣受體是炎性信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導中最重要的跨膜受體蛋白，在膿毒癥免疫反應機制中起著重要作用。Toll樣受體家族中TLR4受體存在于心肌、脾、淋巴細胞中，是革蘭陰性菌細胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的受體。有研究[3]表明，在膿毒癥中，LPS可以通過形成LPS-LPS結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)復合物與TLR4受體結(jié)合，將LPS信號轉(zhuǎn)導到細胞內(nèi)，繼而激活核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號通路，啟動多種炎性因子的釋放，最終導致細胞損傷。

本研究采用CLP術成功建立膿毒癥模型，結(jié)果顯示，CLP組與Sham組、Normal組比較，術后6 h血清CK-MB水平開始升高，12 h達到高峰，24 h仍明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義。這提示CLP術后大鼠出現(xiàn)了明顯的心肌損傷。HE染色顯示，CLP術后24 h心肌組織出現(xiàn)了明顯的病理組織學損傷，膿毒癥致大鼠急性心肌損傷模型制作成功。與Sham組及Normal組比較，CLP組術后6 h心肌組織中TLR4 mRNA表達開始升高，12 h達到高峰，24 h仍明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義。這提示在膿毒癥早期LPS可誘導心肌組織TLR4 mRNA的表達，而心肌組織TLR4 mRNA的高表達可激活NF-κB信號通路，促進多種炎性因子的產(chǎn)生和釋放而導致心肌損傷。

GSH含有巰基，可參與體內(nèi)氧化還原過程，拮抗氧化劑對巰基的破壞，保護細胞膜，同時它還能夠?qū)棺杂苫鶎χ匾K器的損害。因此，目前在臨床上GSH可用于各種原因?qū)е碌母闻K損傷的治療。近年來，GSH用于嚴重膿毒癥致多器官功能損傷干預的研究已引起學術界的重視。有動物實驗研究[4]提示，在膿毒癥早期應用GSH對膿毒癥急性肝損傷具有保護作用，其作用機制可能是與降低肝組織TLR4水平有關。還有研究[5]提示，GSH能抑制急性肺損傷時腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)水平，清除氧自由基，從而對急性肺損傷起保護作用。但是，目前國內(nèi)外對于GSH在膿毒癥急性心肌損傷中應用的研究報告尚不多見。

本研究結(jié)果顯示，大鼠CLP術后出現(xiàn)了明顯的心肌損傷，心肌組織TLR4 mRNA高表達；而如CLP術后早期應用GSH，大鼠6 h、12 h和24 h血清CK-MB水平顯著下降，心肌組織中TLR4 mRNA的表達水平也明顯降低，其24 h的心肌組織病理學損傷性改變也明顯減輕。這提示在膿毒癥早期應用GSH干預對膿毒癥急性心肌損傷具有保護作用，其可能是通過抑制心肌組織中TLR4 mRNA的表達，繼而抑制下游炎性因子的釋放，從而減輕炎性反應導致的急性心肌損傷。

綜上所述，膿毒癥早期心肌組織TLR4 mRNA的高表達在膿毒癥急性心肌損傷中起著重要的作用，而在膿毒癥早期應用GSH干預可抑制心肌組織TLR4 mRNA的表達，繼而抑制下游炎性因子的釋放，從而對膿毒癥致急性心肌損傷起保護作用。

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[2]李振華,董磊,王國興,等.腦利鈉肽、肌鈣蛋白T和I監(jiān)測對重癥膿毒癥和膿毒癥休克預后的意義[J].中華急診醫(yī)學雜志,2012,21(9):1016-1021.

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[4]陳斌,杜施霖,童朝陽,等.膿毒癥大鼠肝臟Toll樣受體4水平及還原型谷胱甘肽的干預研究[J].中國臨床醫(yī)學,2010,17(5):667-670.

[5]劉振威,李玉霞,方閱,等.還原型谷胱甘肽對大鼠急性肺損傷的保護作用[J].中國臨床醫(yī)學,2012,19(6):605-607.