西藏綿羊溶血性曼氏桿菌分離鑒定及藥敏特性研究

江金歡，張麗鴻，汪亞蘋，李奧運，張佳露，參木有，巴桑旺堆，李家奎，2

（1．華中農業大學動物醫學學院，武漢 430070；2.西藏農牧學院動物科技學院，林芝 860000；3.西藏自治區農牧科學院草業科學研究所，拉薩 850009；4.西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所，拉薩 850000）

溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica）原名溶血性巴氏桿菌，是反芻動物（牛、綿羊）肺炎、新生羔羊急性敗血癥的病原菌。本屬成員原屬于巴氏桿菌屬。

Angen 等［1］根據DNA 雜交及16S rRNA 序列分析的結果，建議建立一新屬，其代表種即為溶血性曼氏桿菌。該菌屬于條件致病菌，通常寄生于牛、羊鼻咽部等上呼吸道［2］，在受到應激或感染病毒以后，溶血性曼氏桿菌數量增加并下行到肺部，導致急性肺炎［3］。根據溶血性曼氏桿菌莢膜抗原的不同，將其分為12 個莢膜血清型，其中感染牛引起發病的主要為血清1、6 型，感染羊引起發病的主要為血清2 型［1］。溶血性曼氏桿菌在美國、加拿大、澳大利亞、土耳其等多個國家均有報道，給世界牛、羊養殖業帶來巨大的經濟損失［2-4（］NCBI 網絡數據庫）。我國吉林、山東、安徽、四川、重慶、云南等多個省市均有牛、羊感染溶血性曼氏桿菌導致死亡的情況，給養殖業帶來經濟損失［5-7］。

2017 年8 月，西藏山南市某地某農戶飼養的綿羊出現大批死亡，為查明其發病原因，本研究采集了病死羊心臟、脾臟、小腸、肺臟、氣管等樣品，對病原進行分離和鑒定，并對分離菌株的血清型和耐藥性進行分析，以查明該病致病病菌，從而為該病的臨床診斷和防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品采集

病死綿羊心臟、脾臟、小腸、肺臟、氣管等來自西藏山南市某農戶。

1.2 主要試劑

血瓊脂平板購自青島海博生物技術有限公司；營養瓊脂購自武漢科瑞生物技術有限公司；麥康凱瓊脂購自北京陸橋技術有限責任公司；馬丁肉湯購自青島賓得生物技術有限公司；生化反應試劑、藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司；PCR 試劑、DNA Marker 等均購自杭州新景生物試劑開發有限公司。

1.3 細菌的分離培養

無菌挑取心臟、脾臟、小腸、肺臟、氣管，接種于營養瓊脂和血瓊脂平板上，37 ℃培養24 h。挑取血瓊脂平板上露珠樣單菌落，轉接于血瓊脂平板純化，37 ℃培養24 h。再挑取血瓊脂平板上單菌落，轉接于血瓊脂平板和麥康凱瓊脂，37 ℃培養24 h。挑取血瓊脂平板上純化后的菌落，進行瑞氏染色和革蘭氏染色鏡檢，并挑取血瓊脂平板上單菌落接種于馬丁肉湯中，于37 ℃的空氣浴水平搖床（120 r/min）進行增菌培養24 h。

1.4 分離菌株的生化試驗

按照生化試劑說明書的方法，將分離株的增菌液取10 μL 接種于葡糖糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、血清菊糖、蕈糖、果糖、麥芽糖、鼠李糖生化培養基內，置于37 ℃培養24 h 后，觀察其主要生化特性。

1.5 分離菌株16S rDNA 基因序列的擴增與遺傳進化分析

用水煮加冰浴的方法提取上述溶血性曼氏桿菌分離菌株的基因組DNA。采用文獻［7］的PCR 方法，以16S rDNA 的通用引物進行PCR 擴增，引物序列為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成，擴增長度約1 500 bp。PCR 反應體系50 μL：PCR-MIX 25 μL，ddH2O 21 μL，DNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL。PCR 反應條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃1 min，30 個循環；72 ℃10 min。PCR 擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR 產物由北京擎科新業生物技術有限公司測序。

在NCBI 上利用BLAST 將測序確定的分離株16S rDNA 基因序列同GenBank 數據庫中收錄的親緣關系較近的細菌基因序列進行同源性比對，并從GenBank中下載不同國家、不同宿主、不同時間同源性較高的細菌基因序列20 條，采用Mega7.0 軟件構建該菌的系統發育樹。

1.6 分離菌株莢膜血清型的鑒定

將分離株的基因組DNA 采用Klima 等［8］建立的鑒定該菌株莢膜血清型1、2 和6 的多重PCR 方法進行擴增，分別以Hyp、Core2、TupA為靶基因，引物信息見表1。PCR 反應體系50 μL：PCR-MIX 25 μL，上下游引物3對各0.2 μM，模板DNA 2 μL，補充ddH2O 到50 μL。PCR 反應條件：95℃15 min；94 ℃30 s，55 ℃45 s，72 ℃1 min，35 個循環；72 ℃10 min。PCR 擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 檢測溶血性曼氏桿菌莢膜血清型1、2 和6 的特異性引物序列

1.7 分離菌株的藥敏試驗

按照WHO 推薦的K-B 紙片法挑取分離株進行藥敏試驗。挑取純化的單菌落接種于馬丁肉湯培養基中，37 ℃培養24 h。取100 μL，用無菌推桿均勻涂布于血瓊脂平板，放置藥敏片，37 ℃培養24 h。藥敏結果判定按照美國臨床實驗室標準化委員會（NC-CLS）2009 年標準記錄進行。

1.8 臨床采集樣品中分離株的特異PCR 檢測和主要毒力基因lktA 基因檢測

將純化后的單菌落接種于馬丁肉湯培養基中，37 ℃培養24 h。取2 000 μL，用水煮加冰浴的方法進提取。以其為模板，采用文獻［9］建立的特異性檢測分離株gcp基因和文獻［10］建立的檢測lktA毒力基因的PCR 方法進行擴增，gcp引物序列為5'-TGGGCAATACGAACTACTCGGG-3'/5'-CTTTAATCGTATTCGCAG-3'，預期擴增片段為227 bp；lktA引物序列為5'-CTTACATTTTAGCCCAACGTG-3'/5'-TAAATTCGCAAGATAACGGG-3'，預期擴增片段為497 bp；引物由北京擎科新業生物有限公司合成。PCR 反應體系50 μL：PCR-MIX 25 μL，上下游引物各0.2 μM，DNA 模板2 μL，補充ddH2O 到50 μL。PCR 反應條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個循環；72 ℃10 min。lktA基因PCR 反應條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃40 s，40 個循環；72 ℃10 min。PCR 擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離培養

病料接種于營養瓊脂和血瓊脂平板上，于37 ℃培養24 h。肺臟、氣管接種的血平板長出灰白色、光滑、半透明、露珠樣小菌落（圖1），營養瓊脂上菌落生長貧瘠。挑取血瓊脂平板上露珠樣單菌落接種于麥康凱瓊脂，37 ℃培養24 h，菌落未生長。挑取血瓊脂平板純化后的菌落染色鏡檢，瑞氏染色可見藍紫色的球桿菌；革蘭氏染色可見兩極著色的紅色短桿菌，菌體兩端鈍圓。菌落形態、培養特性、染色特性疑似溶血性曼氏桿菌菌落。

圖1 病死羊肺臟挑菌接種血平板分離菌株菌落生長形態

2.2 分離菌株的生化反應特性

將分離菌株的增菌液接種于生化培養基內，檢測其生化特性，結果顯示該菌株發酵葡萄糖、甘露糖、甘露醇、半乳糖、蔗糖、蕈糖、血清菊糖、果糖、麥芽糖，不發酵乳糖、鼠李糖。生化試驗重復3 次，結果一致（表2）。

表2 分離菌株生化特性

2.3 分離株16S rDNA 基因序列擴增與遺傳進化分析

以分離菌株的DNA 為模板，利用16S rDNA 的通用引物進行PCR 擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約1 500 bp 的位置出現條帶，與預期目的片段相符（圖2）；將測序結果與NCBI 上GenBank 網絡數據庫進行比對，結果顯示為溶血性曼氏桿菌。

圖2 分離菌株16S rDNA 基因PCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

將分離菌株的16S rDNA 基因序列與不同國家、不同宿主、不同時間分離株同源性高的溶血性曼氏桿菌16S rDNA 基因序列做系統發育分析，結果顯示，分離的溶血性曼氏桿菌與2013 年美國株牛源溶血性曼氏桿菌（CP005972.1）遺傳進化關系最近（圖3）。進一步證明分離株為溶血性曼氏桿菌。

2.4 溶血性曼氏桿菌分離株莢膜血清型的鑒定結果

以陽性分離株的基因組DNA 為模板，用特異性鑒定溶血性曼氏桿菌莢膜血清型1、2 和6 的PCR 方法進行擴增，結果顯示在約160 bp（Core2基因）處擴增出目的條帶，證明其為莢膜血清2 型（圖4）。本試驗重復3 次，結果一致，證明分離的溶血性曼氏桿菌為莢膜血清2 型。

2.5 溶血性曼氏桿菌分離株的藥敏試驗

挑取溶血性曼氏桿菌分離株進行藥敏試驗，結果顯示，分離的溶血性曼氏桿菌對環丙沙星、四環素、頭孢呋辛、諾氟沙星、氟苯尼考、紅霉素、氨芐西林、頭孢唑林、多西環素、氯霉素、慶大霉素、新生霉素、阿奇霉素、頭孢拉定、頭孢氨芐、卡那霉素、復方新諾明等17種臨床常用抗生素敏感，對頭孢曲松、頭孢克肟、阿莫西林等3 種藥物中度敏感（表3）。

圖3 溶血性曼氏桿菌16S rDNA 基因的遺傳進化樹

圖4 分離的溶血性曼氏桿菌莢膜血清型多重PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

表3 分離菌株藥敏試驗結果

2.6 溶血性曼氏桿菌分離株PCR 檢測結果

以分離菌株純化后的單菌落增菌液提取基因組DNA 為模板，利用特異性檢測溶血性曼氏桿菌gcp基因的PCR 方法進行擴增，結果顯示gcp基因（圖5）和lktA毒力基因（圖6）均擴增出了目的條帶。表明引起該戶綿羊死亡的病原為溶血性曼氏桿菌。

圖5 分離的溶血性曼氏桿菌gcp 基因PCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

圖6 分離的溶血性曼氏桿菌lktA 基因PCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

本研究在西藏成功分離了溶血性曼氏桿菌，分離株普通瓊脂生長貧瘠，基本不生長；血瓊脂平板生長良好，菌落特性與溶血性曼氏桿菌菌落特性符合。染色特性為革蘭氏陰性兩極著色短桿菌，瑞氏染色為藍紫色球桿菌，與溶血性曼氏桿菌相符。生化特性與文獻［1］記載基本相同，不同之處為文獻［1］記載，該菌不發酵菊糖和甘露糖，但本試驗分離菌株發酵這兩種糖類。分析原因可能為該菌分離自高原動物，在氧氣稀薄、氣候惡劣的環境下，在綿羊體內遺傳進化過程中調控某些生化特性的基因發生改變。

目前，GenBank 中登錄國內的溶血性曼氏桿菌16S rDNA 基因序列僅有9 條。遺傳進化分析結果顯示，該試驗分離的溶血性曼氏桿菌與美國羊源溶血性曼氏桿菌菌株聚為一支，表明分離株與美國羊源菌株遺傳進化關系較近。gcp基因特異性檢測溶血性曼氏桿菌為Shanthalingam 等［9］建立的方法，本試驗使用該方法準確檢測出了分離株，具有較好的特異性。而lktA基因為溶血性曼氏桿菌的毒力基因，并未存在于所有溶血性曼氏桿菌中，溶血性曼氏桿菌的致病性與該基因有關［9］。本試驗采用Bavananthasivam 等［10］檢測lktA基因的方法檢測出分離株存在該基因，以往研究認為該基因與溶血性曼氏桿菌的β-溶血有關，但Bavananthasivam等研究認為，β-溶血可能不是溶血性曼氏桿菌分離株白細胞毒性的可靠指標。本試驗分離株具有lktA基因，但溶血性試驗發現該菌為γ-溶血，即未見溶血環。

溶血性曼氏桿菌已經確定的血清型為12 個，血清型1、2 和6 在不同宿主間流行較為廣泛，也是引起綿羊肺炎較常見血清型［11-12］。不同血清型毒力差別較大，在美國，約60%的病例可分離到6 型菌株［1］。Klima 等［8］建立的檢測血清1、2 和6 的多重PCR 方法操作簡便，較傳統凝集試驗節省時間和人力。本試驗采用該方法簡便、迅速地測出分離株為血清2 型。國內對綿羊溶血性曼氏桿菌血清型流行病學調查較少，而不同血清型毒力差別較大，所以血清型鑒定和流行病學調查對診斷、預防和治療該疾病均有重要意義。

抗生素是治療細菌性疾病的主要措施，了解分離株對臨床常用抗生素的敏感性有利于在臨床爆發溶血性曼氏桿菌疾病時指導用藥。據文獻記載，該菌在國內外均有報道耐藥菌株的出現，其中國外以替米考星、土霉素、氟苯尼考、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、阿莫西林居多［13］，國內以氨芐西林、苯唑西林、頭孢氨芐、先鋒噻肟、頭孢噻吩、頭孢呋肟為主［14］。為了篩選出該分離株敏感性藥物，本研究采用20 種抗生素對分離株進行藥物敏感性試驗，結果發現，該分離株對大多數臨床常用抗生素均表現敏感或中度敏感，無耐藥菌株出現，與文獻［6］記載一致。雖然本試驗分離的溶血性曼氏桿菌對臨床常用抗生素未表現出耐藥性，但國內已經出現耐藥菌株。其中四川、吉林、安徽、重慶均分離出耐藥菌株［5，14］，以重慶肉牛溶血性曼氏桿菌分離株尤為明顯，對卡那霉素、鏈霉素、頭孢呋肟、慶大霉素、先鋒噻肟、頭孢噻吩、頭孢氨芐、苯咗青霉素、羅紅霉素、羧芐青霉素、洛美沙星、氨芐青霉素、青霉素G 等多種臨床常用抗生素表現耐藥性［7］。本研究結果進一步說明了不同地區分離菌株的耐藥性存在差異，同時表明該地區抗生素濫用情況較少。研究結果對該地區治療綿羊感染溶血性曼氏桿菌用藥提供了參考。