早勝牛鈣蛋白酶Ⅰ基因（CAPN1）多態性分析

石福岳，容維中，高 博，徐建峰，王燕燕，董 和，張艷麗

（1.甘肅省畜牧獸醫研究所，平涼 744000；2.平涼市農產品質量安全檢測檢驗中心，甘肅 平涼 744000）

鈣蛋白酶（Calpain）是一種廣泛存在于大多數動物細胞內的半胱氨酸蛋白酶，通過對細胞骨架蛋白、磷酸酶和蛋白激酶的作用，參與細胞凋亡、細胞增殖與分化、信號轉導等［1］。鈣蛋白酶主要位于骨骼肌中的肌纖維Z盤附近和肌質間膜上，分為p94、m-calpain和μ-calpain三種［2］。μ-calpain 又被稱為CAPN1，可以被微摩爾級濃度的Ca2+激活。CAPN1 包含一個80 kD 的大亞基和一個30 kD 的小亞基，參與動物肌肉的生長，且在宰后通過引起肌肉中肌原纖維的水解導致動物肌肉的嫩化［3］。CAPN1基因作為影響肌肉嫩度的候選基因，其生理調控功能和分子生物學特性是近年來研究的重點和熱點之一［4］。Page 等［5］通過直接測序的方法對牛群體CAPN1基因多態性位點進行了研究，在第9 外顯子和第14 外顯子各檢測到一個錯義突變，即外顯子9 的G/C 之間的顛換，導致了蛋白質多肽鏈中第316 位氨基酸由甘氨酸變為丙氨酸，外顯子14 的A/G 之間的轉換，導致第530 位氨基酸有異亮氨酸和纈氨酸兩種可能性。田璐等［6］采用PCR-RFLP 法檢測中國西門塔爾牛CAPN1基因SNPs 位點的多態性，結果表明，CAPN1316 位點和CAPN14 751 位點分別發生C/G 顛換和C/T 轉換，且兩位點與牛肉大理石花紋以及剪切力相關。

早勝牛是隴東地區長期自然選育形成的優良地方類群，其體質結實、體驅緊湊、骨骼較粗、肌肉豐滿、肉用性能好，已成為隴東地區養殖的主導肉牛群體。但是由于近年來盲目引種，造成牛種混雜，生產性能不穩定或下降，尤其是一些固有特性及優勢基因逐漸流失，對其保護和利用形成了較大威脅。本研究通過DNA 池測序法檢測早勝牛CAPN1基因22 個外顯子的SNPs 位點，分析其多態性以及遺傳多樣性，為下一步分析其與早勝牛肉質的相關性打下基礎，也為采用分子育種方法提高早勝牛肉用性能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗早勝牛血樣采自慶陽市寧縣的早勝牛養殖場或專業合作社，共采集血樣320 份，加抗凝劑搖勻后，置于-20℃冷凍保存備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取及DNA 混合池的構建 基因組DNA使用OMEGA 全血DNA 提取試劑盒提取，TE 緩沖液溶解，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，并用分光光度計NanoDrop2000 測定濃度和OD260/OD280，將DNA 樣品稀釋至100 ng/μL。每個樣本取5 μL，每10 個樣本構成一個混合池，再以混合池為模板進行PCR 擴增。

1.2.2 引物設計及PCR 擴增 參考GenBank 數據庫中牛的CAPN1基因序列（登錄號：AH009246），使用軟件Primer 5 及Oligo 6 進行引物設計，對早勝牛CAPN1基因的22 個外顯子進行擴增，引物詳細信息見表1。

表1 早勝牛CAPN1 基因引物信息

以DNA 混合池為模版進行PCR 擴增，PCR 反應體系為25 μL，包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL（10 pmol）、DNA 模版1 μL（100 ng），ddH2O 9.5μL。PCR 擴增反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性35 s，退火30 s，72℃延伸30 min，32 個循環；最后72℃延伸10 min；產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取條帶清晰、特異性良好的PCR 產物委托北京天一輝遠生物科技有限公司進行測序。

1.3 數據的統計分析

將測序得到的DNA 序列用DNAStar 軟件中的SeqMan、Editseq 等程序進行拼接，排列同源序列并進行人工校正，用DNAStar 軟件中MegAlign 進行序列比對，以便分析其SNPs 位點。利用測序圖看圖軟件Chromas和MWSnap 測量各SNP 位點等位基因峰高，根據以下公式估算等位基因頻率［7］。

式中f i表示SNP 位點某等位基因頻率，h1和h2分別表示測序圖上該SNP 等位基因1、2 峰高度。

2 結果與分析

2.1 DNA 提取結果

采用試劑盒法提取的血液DNA，用核酸蛋白測定儀檢測濃度和純度，其OD260/OD280在1.8～2.0 之間。 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后結果如圖1，結果顯示，所提取的DNA 濃度較高，無雜帶及拖尾現象。表明提取的DNA純度較高，無蛋白質等雜質污染，可以用于后續試驗。

圖1 血液DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

2.2 PCR 擴增結果

以DNA 混合池為模版，用15 對引物分別對早勝牛CAPN1基因外顯子進行PCR 擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（如圖2），由圖2 可以看出，各引物擴增產物條帶清晰，且特異性較好，與預期擴增產物大小一致。

圖2 PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

2.3 序列分析

測序結果經DNAStar 軟件的分析和比對，結果只有引物CA3、CA5、CA8、CA12、CA13 和CA14 的擴增產物檢測到堿基突變（測序峰如圖3）。CA3 引物擴增產物包括Exon5 和Exon6，在Exon5 的3 717 bp 處檢測到一個G/A 突變，該突變為同義突變。在Exon6 的3 854 bp處檢測到A/G 突變，導致異亮氨酸/纈氨酸突變。CA5引物擴增產物包括部分Exon8、全部Exon9 和部分Exon10，其中在Exon9 的5 709 bp 處檢測到C/G 顛換，并引起丙氨酸/甘氨酸突變。CA8 引物擴增產物為部分Exon13 和全部的Exon14，其中Exon14 的11 058 位點發生G/A 突變，該堿基突變引起氨基酸由纈氨酸突變為異亮氨酸。CA12 擴增產物包括Exon21 和部分Exon22，其中，在Exon22 的15 299 bp 處發生G/A 突變，但該突變為同義突變，未引起氨基酸的改變。CA13引物擴增產物包括部分Exon22，其中在15 682 處發生G/C 顛換，引起半胱氨酸/絲氨酸的突變。CA14 引物擴增產物為Exon10，與參考序列相比在6 004 bp 處發生C/T 突變，并導致所編碼氨基酸由精氨酸突變為終止密碼子。

圖3 測序峰圖

2.4 等位基因頻率估算

利用MWSnap 軟件的標尺分別測量7 個SNPs 等位基因峰高，根據公式估算各SNPs 位點的等位基因頻率，結果見表2。如表2 所示，SNPs 位點C5709G 和C6004T 的突變型等位基因的頻率均大于野生型等位基因的頻率，而其余SNPs 位點的野生型等位基因頻率均大于突變型等位基因的頻率。

表2 各SNPs 位點等位基因頻率估算結果

3 討論

鈣蛋白酶是一種廣泛存在于動物細胞中的蛋白水解酶。大量的研究表明，CAPN 參與了肌肉中肌原纖維的水解過程，因此也直接參與了肌肉生長和畜禽屠宰后嫩化的過程。Smith 等［8］將影響豬肉嫩度性狀的QTL位點定位在該基因上。長期以來，CAPN1基因的遺傳變異及其對牛肉嫩度效應的相關研究較多。曹陽等［9］對草原紅牛CAPN1基因第5 外顯子進行SNPs 分析后，發現其第5 外顯子存在A3717G 突變，突變后的多態導致牛肉剪切力值及肌纖維直徑等肉質性狀呈現不同程度的差異，表明該位點可能是CAPN1基因上一個重要的SNP 位點。武秀香等［10］采用PCR-SSCP 方法對中國黃牛不同群體中的CAPN1基因的遺傳變異進行了研究，結果檢測到A4558G 和C4684T 兩個突變位點，并發現多態位點對牛肉嫩度和大理石花紋有顯著效應，且A4558G 和C4684T 位點對肉嫩度的影響具有累加作用。張彩霞等［11］、陳曉杰［12］在不同類群牛CAPN1基因第9 外顯子處分別檢測到G458C、G5709C 突變，且G為優勢等位基因。姜成國等［13］對草原紅牛、延邊黃牛CAPN1基因第14 內含子區4 685 位點進行了多態性與肉質嫩度分析，結果發現該位點存在C/T 突變，且該變異與肉嫩度、眼肌面積存在一定程度的相關性。

本研究采用DNA 混合池測序法對早勝牛CAPN1基因22 個外顯子的多態性位點進行了研究，結果共檢測到7 個SNPs 位點，包括G3717A、A3854G、C5709G、C6004T、G11058A、G15299A 和G15682A。其中，G3717A位于第5 外顯子，但不會導致氨基酸的改變，屬同義突變。這一結果與姜成國等［13］的研究結果一致。A3854G位于第6 外顯子，導致氨基酸由異亮氨酸變為纈氨酸。C5709G 突變位于第9 外顯子，導致氨基酸發生丙氨酸/甘氨酸突變，此結果與Page 等［5］、田璐等［6］、張彩霞等［10］、陳曉杰［11］等的研究結果一致。C6004T 突變位于第10 外顯子處，這一堿基突變引起氨基酸由精氨酸變為終止密碼子，可能會導致蛋白質翻譯過程的終止，從而影響基因的表達過程。C5709G 和C6004T 兩個SNPs 位點的突變等位基因頻率高于突變前等位基因頻率，其對早勝牛肉質性狀等的影響還需要進一步研究。G11058A位于第14 外顯子，并引起纈氨酸/異亮氨酸的突變，這一結果與Page 等［5］的研究結果一致。G15299A、G15682A位于第22 外顯子，G15299A 為同義突變，未引起氨基酸的改變，而G15682A 突變引起氨基酸發生半胱氨酸/絲氨酸的突變。A3854G、C6004T、G15299A、G15682A 這4 個突變位點為本研究首次發現。今后還需對其擴大樣本量或采取其他研究方法進行驗證，并對其與肉質性狀的相關性進行深入分析。

本研究主要針對CAPN1基因的全部外顯子，對其內含子、5’-UTR 和3’-UTR 等區域尚未進行研究，今后將對這些區域多態性進行進一步的研究，并對其與肉質性狀、胴體性狀以及肌肉纖維等性狀的相關性進行分析。

4 小結

本研究對早勝牛CAPN1基因的全部外顯子多態性進行了分析，共檢測到7 個多態性位點，其中3 個位點與前人的研究結果一致，且已有研究表明這些遺傳變異與肉質嫩度、大理石花紋等性狀相關，表明其可能作為肉品質相關候選基因的作用。其余4 個為本研究首次發現的位點，今后將對這些多態位點與經濟性狀的相關性進行進一步的研究分析。