綿羊FSTL3 基因g.40674542C>T 位點多態性與產羔數的關聯分析

陳煒昊，田志龍，孫 偉，儲明星

（1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；3.河南科技大學動物科技學院，洛陽 471003）

綿羊產羔性狀遺傳力只有0.05～0.15，常規育種手段難以滿足現代畜牧業對于產羔性狀改良的需求［1］。標記輔助選擇能夠極大地提高如綿羊產羔性狀這樣低遺傳力性狀的選擇效率，而找到與產羔性狀位點相連鎖的標記，則是實現標記輔助選擇的基礎［2］。研究表明，綿羊屬于季節性繁殖動物，在光照逐漸縮短的秋冬季節開始性腺活動，在冬春之交時結束［3］。綿羊季節性繁殖活動受下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）系統的調控［4］，與生殖激素的變化密切相關。促性腺激素釋放激素（GnRH）的釋放與卵巢生殖活動的季節性變化聯系緊密，乏情期下丘腦GnRH 對雌激素的負反饋響應迅速增加，進而調控綿羊的季節性繁殖［5］。

卵泡抑素樣蛋白3（Follistatin-like protein 3，FSTL3），又名卵泡抑素相關基因蛋白（Follistatin related-gene，FLRG）。綿羊FSTL3基因定位于5 號染色體上，共編碼263 個氨基酸，包含5 個外顯子［6］。FSTL3基因大量表達于胎盤、睪丸、心臟和胰腺等組織中，與生殖功能的調控密切相關［7］。FSTL3基因在維持妊娠方面也扮演了重要角色［8］，在大鼠懷孕后期，子宮和蛻膜中的FSTL3表達水平顯著升高，并且胎盤中FSTL3的mRNA 水平顯著高于卵巢［9］，在女性月經周期和懷孕初期，子宮內膜的基質細胞FSTL3表達水平顯著升高［10］，分娩時血清中FSTL3表達水平顯著增長［11］。因此，推測FSTL3基因可能同樣對于綿羊的繁殖性狀有一定的影響。本研究針對不同發情模式的綿羊品種（季節性發情和常年發情），通過對綿羊FSTL3基因的測序，探討其多態位點與綿羊產羔數的關聯性，尋找新的多態位點，為進一步開展綿羊產羔機理的研究和分子標記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 血樣及數據采集

21 只蘇尼特羊血液樣本采自內蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗民羊牧業有限責任公司，22 只灘羊血液樣本采自寧夏鹽池縣寧夏朔牧鹽池灘羊繁育有限公司，161只草原藏羊血液樣本采自西藏當雄縣，101 只湖羊血液樣本采自江蘇省徐州申寧羊業有限公司，52 只策勒黑羊血液樣本采自新疆和田市策勒縣，380 只小尾寒羊血液樣品采自山東省鄆城縣誠聯小尾寒羊種羊場。所有羊只均采用頸靜脈采血，檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃保存。同時記錄小尾寒羊產羔季節、胎次與產羔數。

1.2 DNA 提取

使用TIANGEN（天根）血液DNA 試劑盒提取試驗綿羊血液樣本DNA，Nano Drop2000 檢測DNA 樣本濃度，并使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量。

1.3 基因分型

對FSTL3基因g.40674542C＞T 位點在常年發情和季節性發情綿羊品種中進行基因分型，采用Sequenom MassARRAY?SNP 技術對該位點進行基因型檢測［12］。分型樣品為DNA，每個樣品需要量20 μL，DNA 濃度40～80 ng/μL。

1.4 數據處理

使用Microsoft Excel 2016 軟件統計綿羊FSTL3基因g.40674542C＞T 位點的基因型頻率、等位基因頻率、多態信息含量、雜合度和有效等位基因數。隨后進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗。

使用最小二乘法進行小尾寒羊FSTL3不同基因型之間的分析，建立的線性模型為：

式中，yijkl為產羔數的記錄值；μ 為群體平均值；LSi為第i個產羔季節的固定效應；Pj為第j個胎次的固定效應；Gk為FSTL3基因第k種基因型的固定效應；eijkl為隨機殘差效應。使用SPSS 19.0 軟件進行小尾寒羊基因型與產羔表型數據關聯分析，所有數據以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 FSTL3 基因多態性分析

由圖1 可知，FSTL3基因g.40674542C＞T 位點在季節性發情、常年發情綿羊品種中均存在CC、TC 和TT三種基因型。

從表1 可知，綿羊FSTL3基因g.40674542C＞T 位點基因型頻率和等位基因頻率在季節性發情、常年發情綿羊品種間差異均不顯著（P＞0.05），且在季節性發情、常年發情綿羊品種中C 均為優勢等位基因。

圖1 FSTL3 基因g.40674542C＞T 位點分型結果

表1 FSTL3 基因g.40674542C＞T 位點在季節性發情、常年發情綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

從表2 可知，綿羊FSTL3基因g.40674542C>T 位點在6 個綿羊品種中均表現為低度多態（PIC<0.25）。卡方適合性檢驗結果表明，該位點在小尾寒羊、湖羊和草原型藏羊中處于哈代溫伯格平衡狀態（P>0.05），在其余3個綿羊品種中處于哈代溫伯格不平衡狀態。

表2 FSTL3 基因g.40674542C＞T 位點在不同綿羊品種中的群體遺傳學分析

2.2 FSTL3 基因g.40674542C>T 位點與小尾寒羊產羔數的關系

從表3 可知，FSTL3基因g.40674542C>T 位點不同基因型與小尾寒羊不同胎次產羔數之間均無顯著關聯（P>0.05）。

表3 FSTL3 基因g.40674542C＞T 位點各基因型小尾寒羊產羔數 只

3 討論

卵泡抑素樣蛋白3（FSTL3）廣泛分布在哺乳動物生殖系統各個組織器官中，在胎盤中表達最高，其次是睪丸、胰腺和心臟。FSTL3基因屬于TGF-β 超家族，能夠與BMPs、肌生成抑制素和活化素等進行特異性結合，使其近乎被全部裂解，無法與相應受體結合［13-14］，抑制Smad 蛋白介導的細胞內信號轉導，影響TGF-β 超家族成員靶向調控基因轉錄［15］，進而抑制TGF-β 的生物學功能。BMPs 家族中的許多成員參與調節卵泡的發生及排卵［16］，并且BMP-Smad信號通路中的許多信號分子基因都與動物繁殖相關，參與調控產羔數、排卵數等性狀［17］。研究表明，BMP4可以誘導原始生殖細胞（PGCs）的形成、增殖和定向遷移［18］，Smad1基因敲除小鼠表現為胚胎死亡，不產生或極少形成PGCs［19］，Smad5基因敲除小鼠表現與Smad1基因敲除小鼠相似［20］。由此可知，FSTL3基因通過介導調控BMP-Smad 信號通路，進而影響動物排卵。FSTL3基因在動物生殖調控上也有著重要的地位。研究表明，FSTL3基因在卵巢儲備功能下降綜合癥患者的卵巢中表達量與正常相比顯著下降［21］，也可作為妊娠早期早發型先兆子癇的生物標志物［22］，其敲除小鼠相比于正常小鼠表現為成年時睪丸增大和生殖細胞數量增加［23］，在FSTL3基因系統性過表達小鼠中，胰島素和胰高血糖素敏感性顯著增加［24］，在小鼠性腺軸中過表達FSTL3基因后，雄性小鼠性腺重量、精子數和生育力顯著降低，雌性小鼠產仔數顯著減少［25］。綜上所述，FSTL3基因在動物繁殖中的作用至關重要，但目前FSTL3基因對于綿羊繁殖的影響鮮有報道，因此探索FSTL3基因對于綿羊繁殖的影響尤為重要。

群體遺傳學分析發現，FSTL3基因g.40674542C>T位點在6 個綿羊品種中均表現為低度多態（PIC<0.25），表明該位點在6 個綿羊品種中的遺傳多樣性相對貧乏，另外，FSTL3基因g.40674542C>T 位點在灘羊、蘇尼特羊和策勒黑羊中處于哈代溫伯格不平衡狀態，可能是因為自然選擇或人工選擇對該位點分布影響較大，也可能與選擇的綿羊品種數量較少有關。關聯分析結果顯示，FSTL3基因g.40674542C>T 位點CC 型各胎產羔數均高于TC 型，推測該位點突變在一定程度上降低了小尾寒羊的產羔能力。

研究表明，突變能顯著改變動物表型。1982 年Davis 等在澳大利亞布魯拉綿羊品種發現的FecB 突變，就是在BMPRIB基因的第746 位發生A>G 突變導致的，最終顯著提高了布魯拉綿羊的排卵數和產羔數［26］。本研究在FSTL3基因上發現1 個多態位點g.40674542C>T，發生于第2 外顯子，沒有引起氨基酸的改變，屬于同義突變，同義突變不會造成對應氨基酸的改變，但單核苷酸的替換會改變mRNA 的剪切效率或準確性，從而影響蛋白質表達水平［27］，同義突變還可通過改變mRNA的構象，從而降低mRNA 的穩定性，影響多肽鏈的三維折疊及修飾加工的過程，進一步改變蛋白質的結構或功能，最終對動物表型產生影響［28］。因此，FSTL3基因g.40674542C>T 位點可能對于綿羊產羔數有一定的影響。

4 結論

本研究篩選出綿羊FSTL3基因新的突變位點g.40674542C>T，其與小尾寒羊各胎次產羔數之間沒有顯著關聯（P＞0.05），FSTL3基因g.40674542C>T 位點不適合用于小尾寒羊產羔性狀的選育。