頂空-氣相色譜-飛行時間質譜鑒定分析飲用水中的異味成分

蔣萬楓, 張 寧, 張輝珍

(青島市食品藥品檢驗研究院, 山東 青島 266071)

水被稱為人類生命的源泉,是包括人類在內所有生命生存的重要資源,也是生物體最重要的組成部分。飲水安全關系著億萬百姓的健康和生命安全[1]。水在常溫常壓下為無色無味的透明液體,但在生產加工或存儲過程中可能會產生異味,飲用水中出現異味雖然不一定會對消費者造成直接的健康危害,但是容易引起消費者的恐慌和對水質的懷疑[2]。《食品安全國家標準包裝飲用水》(GB 19298-2014)、《食品安全國家標準飲用天然礦泉水》(GB 8537-2018)感官要求中的滋味、氣味項目均為無異味、無異嗅。

頂空-氣相色譜是在已達到平衡的密閉容器中液體或固體分析物的頂部空間取氣態(或蒸氣)樣品,并與氣相色譜結合對氣態(或蒸氣)樣品進行分析的一種比較特殊的分析技術[3]。飛行時間質譜具有高分辨能力、高采集速率、精確質量全譜采集等特點[4]。這兩項技術已廣泛應用于風味成分分析[5-11]。差異化分析軟件基于質譜數據的差異分析,以確定樣品組和變量之間的關系,已廣泛應用于食品鑒定分析中[12-15]。本文利用頂空-氣相色譜的高分離能力、飛行時間質譜的高分辨力和差異化分析軟件的高效數據分析能力,對消費者投訴的具有異味的飲用水進行鑒定分析,確定其中的異味成分,分析產生的原因,并對相應的生產加工工藝提出合理化建議。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent7890A-7250型氣相色譜-飛行時間質譜、COMBI PAL型全自動三位一體進樣器、20 mL頂空瓶、Mass Hunter定性定量分析軟件、Mass Profiler Professional (MPP)差異化分析軟件(美國Agilent公司); AL 204天平(瑞士梅特勒特里多公司); NIST譜庫(美國國家標準與技術研究院);超純水機(德國賽多利斯公司)。氯化鈉(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)、乙醛標準溶液(1 000 mg/L)(英國LGC公司)。

1.2 差異化分析實驗方法

1.2.1頂空進樣條件

樣品量:10 mL;進樣加熱箱溫度:70 ℃;進樣針溫度:80 ℃;樣品加熱同時振搖頻率:500 r/min;平衡時間:20 min;進樣量:500 μL。

1.2.2色譜條件

色譜柱:DB-1MS柱(30 m×0. 25 mm×0. 25 μm,美國Agilent公司)。升溫程序:初始溫度50 ℃,保持1 min,以5 ℃/min的速度升溫至245 ℃,保持5 min;進樣口溫度:250 ℃;進樣模式:脈沖分流進樣;脈沖壓力:103.4 kPa;分流比:20∶1,持續0.5 min;載氣:高純氦氣;恒流流速:1.0 mL/min。

1.2.3質譜條件

傳輸線溫度:280 ℃;電離模式:EI源;數據采集方式:飛行時間質譜(TOF MS);質量掃描范圍:m/z40～800;溶劑延遲時間:0 min;采集速率:3.00 spectra/s。

1.3 乙醛測定方法

1.3.1頂空進樣條件

樣品量:12 mL;進樣加熱箱溫度:80 ℃;進樣針溫度:90 ℃,樣品加熱同時振搖頻率:500 r/min;平衡時間:20 min;進樣量:750 μL。

1.3.2色譜條件

色譜柱:DB-1MS柱(30 m×0. 25 mm×0. 25 μm);升溫程序:初始溫度50 ℃,保持3 min,以20 ℃/min的速度升溫至150 ℃,保持5 min;進樣口溫度:250 ℃;進樣模式:脈沖分流進樣;脈沖壓力:103.4 kPa;分流比:10∶1;持續0.5 min;載氣:高純氦氣;恒流流速:0.8 mL/min。

1.3.3質譜條件

傳輸線溫度:280 ℃;電離模式:EI源;數據采集方式:TOF MS,質量掃描范圍:m/z40～400;溶劑延遲時間:2.3 min;采集速率:3.00 spectra/s。

2 結果與討論

2.1 差異化分析數據準備

分別取5個帶有異味的水樣品和4個無異味的水樣品,按1.2節方法分別檢測。由于異味物質含量低,無法從總離子流圖(見圖1)直接看出其差異性,找到異味物質,需要進行“分子特征提取(MFE)”,通過分子特征提取色譜圖中的各化合物,將這些化合物導入MPP軟件,設置最小絕對豐度為10 000,所需離子數為2,保留時間偏差為0.1 min,精確計量數偏差為20 ppm(10-6,下同),進行化合物比對,從這9個樣品中共分析出124種不同化合物,將這些化合物的信息導出為CEF格式文件,導入到Mass Hunter定性分析軟件中,再次檢查色譜圖,用“分子式查找化合物”工具專門搜索這些化合物,然后將得到的化合物返回到MPP軟件中,進行第二輪化合物比對和過濾,防止在分子特征提取過程中遺漏化合物。

圖 1 有異味水和無異味水的總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatography (TIC) of non-odorous and odorous water

2.2 差異化分析

在MPP軟件中,對導入的數據進行主成分分析,從主成分分析圖(見圖2)上可以看出,在無監督模式下有異味水和無異味水不能在3D圖上很好地區分開,說明2種水主成分差異不明顯。

圖 2 有異味水和無異味水的主成分分析圖Fig. 2 Principal component analysis of odorous and non-odorous water

分別采用按標志篩選、按頻率篩選、按變異系數篩選等進行處理,通過逐級篩查,化合物數量降低。在有監督模式下,逐級篩選出有異味水和無異味水的差異化合物。通過T檢驗統計分析查找差異明顯的化合物,一般認為P<0.05差異顯著。同時計算倍數變化(fold change),用標準化后的兩組數據相除得到倍數,一般2倍表明兩組數據有顯著差異。火山圖可反映兩種水中化合物的差異情況,其橫坐標代表log2(fold change),縱坐標表示-log10(P值),每個點代表一個化合物。從火山圖(見圖3)中明顯看出兩種水之間的2個差異化合物,經NIST譜庫檢索和結構解析,其中一個化合物為二氧化碳,另一個化合物為乙醛。二氧化碳為無色無味氣體,所以初步確定異味物質為乙醛。

圖 3 (左)有異味水和(右)無異味水的差異火山圖Fig. 3 Differential volcanoes of (left) odorous and (right) non-odorous waterLeft and right bounded by abscissa 0.

從質譜圖(見圖4)可以看出,m/z44.025 7、43.017 9、42.009 9、45.029 0分別為乙醛的M+、[M-H]+、[M-2H]+和其中一個碳為13C的同位素離子,另外m/z43.989 3、44.992 7分別為CO2離子及其同位素離子,所有離子質量偏差均在5 ppm內(見表1和圖4)。乙醛和二氧化碳分子離子的精確質量數相差0.036 4 Da,在飛行時間質譜上能輕易分開,提取m/z44.025 7,窗口為10 ppm,可看出乙醛在有異味的水和無異味水中的含量有明顯差別(見圖5)。經與乙醛標準品對照,其保留時間和特征離子均一致,經食品感官品評員鑒別有異味水的氣味和滋味與乙醛標準品的水溶液相同,確認異味成分為乙醛。

圖 4 樣品中異味物質的質譜圖解析Fig. 4 Mass spectrographic analysis of odorous substances in samples

Molecular formulaIon speciesTheoretical m/zMeasured m/zOffset/ppm (10-6)C2H2O[M-2H]+42.010042.00992.76C2H3O[M-H]+43.017843.0179-1.37C2H4OM+44.025744.02570.00C13CH4OM+45.029045.02900.00CO2M+43.989343.98930.00C13CO2M+44.992644.9927-1.43

圖 5 有異味水和無異味水中乙醛的質譜圖Fig. 5 Mass spectrum of odorous and non-odorous water

2.3 乙醛檢測方法優化

在上述鑒定異味水中異味物質的過程中,所采用的試驗方法并非針對乙醛建立的。因而不是最優的方法,為提高方法的檢出限,需要針對乙醛對方法進行優化。頂空處理實驗中通常在水溶液中加入鹽類物質,以此降低有機物在水中的溶解度,提高頂空富集效率,氯化鈉與硫酸鈉是最常使用的鹽類,所以本試驗選取了這兩種鹽進行對比。一般情況下,加入的鹽越多,頂空富集效率越高,響應值越高。在初始選擇加入鹽的種類時,分別加入飽和氯化鈉和飽和硫酸鈉,即分別在10 mL樣品中加入3.6 g氯化鈉和4.0 g硫酸鈉,考察其影響,結果表明,加入硫酸鈉的樣品響應值較大。除鹽效應外,影響頂空響應的因素還有加熱時間、加熱溫度、樣品量和加鹽量,為此設計了一個四因素三水平的正交試驗,從試驗結果(表2)可以看出,響應值隨樣品量和溫度的升高而增加,隨時間的延長先增加后下降,隨加鹽量增加而減少。所以最終確定方法為樣品量為12.5 g,加熱溫度為80 ℃、加熱時間20 min,加入硫酸鈉的量為2 g。

表 2 乙醛檢測方法正交試驗優化結果表

2.4 方法學驗證

將乙醛標準溶液配成0.010、0.020、0.050、0.100和0.500 mg/L的標準系列,按優化好的乙醛檢測條件進行檢測,以乙醛的峰面積(y)為縱坐標,以對應的質量濃度(x, mg/L)為橫坐標,在0.010～0.500 mg/L范圍內,求得線性回歸方程y=1.05×105x-1.34×104,相關系數R2=0.997。按照樣品分析的全部步驟,根據GB/T 27404-2008附錄F的要求重復20次測定空白樣品,計算20次平行測定的標準偏差S,按3倍和10倍標準偏差計算乙醛的檢出限和定量限分別為0.003 3和0.010 mg/L。

2.5 樣品加標回收率及精密度

向水樣中分別加入0.020和0.050 mg/L乙醛標準溶液,用1.3節方法進行測定,平行測定6次,低濃度平均回收率為91.3%,高濃度平均回收率為94.8%。日間精密度為1.70%～8.72%,日內精密度為0.17%～9.85%。

2.6 實際樣品檢測

對市場上銷售的11種飲用水進行了乙醛檢測,其中9種聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)瓶裝水中乙醛的含量為0.017～0.075 mg/L不等,聚碳酸酯(PC)桶裝水未檢出乙醛(見表3)。影響乙醛產生的因素有加熱時間、加熱溫度、粒料濕度等,另外,儲存溫度和光照也會影響乙醛從瓶到水的遷移速度[16,17], PET在高溫下熱氧化降解后易產生乙醛。不同文獻報道的乙醛的閾值(人的嗅覺或味覺能夠感知到的最低濃度)不同,在空氣中的閾值有0.001 3 ppm(10-6)和0.018 ppm[18],清水中的閾值為0.032～0.500 mg/L[19]。經過本實驗室的比較,認為其在飲用水中的閾值為0.030 mg/L,超過此數值氣味比較明顯,能夠很容易分辨出來。PET在制胚和吹瓶過程中均有加熱工藝,為分析乙醛是在哪個過程中產生的,分別取5 g粒料、瓶胚和瓶,用液氮冷凍后粉碎,頂空加熱80 ℃,保持20 min,用氣相色譜-飛行時間質譜檢測乙醛的響應值,峰面積分別為59 906、11 479 432、11 784 644,可以看出乙醛主要來自制胚過程,建議生產廠家優化制胚參數,改善生產加工工藝,降低乙醛的產生,保證飲用水質量安全。

表 3 飲用水中乙醛的含量

PET: polyethylene terephthalate; PC: polycarbonate.

3 結論

使用頂空-氣相色譜-飛行時間質譜分別采集有異味和無異味的飲用水,通過差異化分析軟件鑒定分析出了異味化合物,利用結構解析確定為乙醛。建立了三水平四因素的正交試驗,對樣品量、頂空溫度、頂空時間、樣品中加鹽量等試驗條件進行了優化,確立的方法具有較低的檢出限,較高的精密度和準確度。通過實際樣品的檢測數據,分析出了產生異味的原因,并對相應的生產加工工藝提出了合理化建議。