氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定肉制品中10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物

朱萌萌, 葉 群, 周婷婷, 陳盧濤, 俞璐萍, 黎 斌, 胡晉峰, 周 敏*

(1. 綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司, 浙江 杭州 310000; 2. 浙江茗皇天然食品開發(fā)股份有限公司, 浙江 杭州 310000; 3. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院, 茶葉生物與利用國家重點實驗室, 安徽 合肥 230036)

N-亞硝胺類化合物在食品、飲用水、消費品以及污染的空氣中廣泛存在,常見于腌制、煙熏、烘烤等肉制品中[1-3]。Yurchenko和Molder[4]對愛沙尼亞2001～2005年間386個不同肉制品樣品(原料肉、油炸肉、煙熏肉、腌漬肉、烤肉和罐頭肉)進行了5種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的分析,分別檢出了N-亞硝基二甲胺(N-nitrosodimethylamine, NDMA)、N-亞硝基二乙胺(N-nitrosodiethylamine, NDEA)、N-亞硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine, NPYR)、N-亞硝基哌啶(N-nitrosopiperidine, NPIP)和N-亞硝基二丁胺(N-nitrosodibutylamine, NDBA),總揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的平均含量為3.97 μg/kg。肉類產(chǎn)品經(jīng)煙熏、油炸、焙烤和腌漬等工藝加工和儲藏后,會產(chǎn)生獨特的風(fēng)味,并可延長保質(zhì)期,深受中國消費者的喜愛,但其在加工過程中,會使用硝酸鹽和亞硝酸鹽作為防腐劑和發(fā)色劑,在微生物的作用下蛋白質(zhì)、氨基酸降解產(chǎn)生胺類物質(zhì),適宜條件下,亞硝酸鹽與胺類物質(zhì)發(fā)生亞硝基化作用,從而產(chǎn)生具有強致癌性的N-亞硝胺類化合物[5,6]。目前,已有大量研究表明,N-亞硝胺類化合物是一類具有強毒性的化合物,對機體的神經(jīng)和腎臟具有致畸性和致癌性[7,8],超過300多種N-亞硝胺類化合物在一種或多種動物身上顯示出致癌作用[9]。1987年國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)將亞硝胺定義為有強致癌性的食物污染物,N-亞硝基二甲胺和N-亞硝基二乙胺被列為2A類致癌物,具有潛在的致癌性,其他亞硝胺為2B級,是可能致癌物。中國一些地區(qū)胃癌和食道癌的發(fā)病率較高,這可能與當?shù)鼐用裣矚g食用煙熏肉和腌制食品等習(xí)慣有關(guān)。我國GB 2762-2017標準《食品安全國家標準 食品中污染物限量》中規(guī)定肉及肉制品中N-二甲基亞硝胺的限量值為3.0 μg/kg。

近年來,N-亞硝胺類化合物的檢測方法主要有氣相色譜-熱能分析儀法(GC-TEA)[10]、氣相色譜-氮磷檢測器法(GC-NPD)[11]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[12,13]、高效液相色譜法(HPLC)[14]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[15,16]。GB 5009.26-2016標準《食品安全國家標準 食品中N-亞硝胺類化合物的測定》中第二法使用GC-TEA對N-二甲基亞硝胺進行測定,方法檢出限為0.15 μg/kg,但熱能分析儀價格昂貴且專一性極強(僅對含氮化合物具有高選擇性),普及面窄,不適合大面積推廣使用。高效液相色譜-質(zhì)譜法可以對非揮發(fā)性、相對分子質(zhì)量較高的亞硝胺具有良好的分析能力,多用于飲用水及污水中非揮發(fā)性亞硝胺物質(zhì)的檢測[17]。

前處理方法主要包括液液萃取法、固相微萃取法(SPME)[18,19]、水蒸氣蒸餾萃取法、超臨界萃取法[20]和QuEChERS等。趙莊等[21]采用QuEChERS結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對酸肉中的10種揮發(fā)性亞硝胺化合物進行檢測,樣品濃縮5倍,定量限為0.1～1.0 μg/kg。而亞硝胺類化合物具有強親水性和強極性,導(dǎo)致其較難從水相中分離[22],且N-亞硝胺類化合物在肉制品中的含量極低,往往隨時間、空間波動較大,需要較高的濃縮倍數(shù)來提高方法檢出限,最常用的方法是使用水蒸氣蒸餾萃取法,可實現(xiàn)樣品濃縮100～200倍,但其操作繁瑣耗時,前處理步驟多,回收率不穩(wěn)定。氣相色譜-質(zhì)譜法選擇性好、靈敏度高,已廣泛用于揮發(fā)性亞硝胺類化合物的測定[23]。同時蒸餾萃取法(simultaneous distillation extraction, SDE)與水蒸氣蒸餾萃取法相似,在不改變富集倍數(shù)的情況下,可實現(xiàn)蒸餾與提取同時進行,具有更好的重復(fù)性和萃取率,操作簡便,檢出限更低,已廣泛用于食品尤其是肉類產(chǎn)品中揮發(fā)性化合物的提取[24]。

本文擬采用優(yōu)化后的SDE結(jié)合GC-MS/MS,建立一種操作簡單、穩(wěn)定性高、檢出限低、靈敏度高的分析方法,用于肉制品中10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的檢測分析。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

GC-2010 plus氣相色譜儀、TQ8040質(zhì)譜儀(日本Shimadzu公司);同時蒸餾萃取裝置(泰州市世星教學(xué)設(shè)備有限公司); ST-16R離心機(美國Thermo Fisher公司); BSA2202S電子天平(德國Sartorius公司); Reeko AutoEVA-20全自動氮吹濃縮儀(杭州博睿科儀器有限公司); HH-WO可升降恒溫水浴鍋(鄭州予創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司); ZNHW智能恒溫數(shù)顯電熱套(上海湃瀾儀器設(shè)備有限公司); DLSB-5L/10低溫冷卻液循環(huán)泵(鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司);漩渦混合器(美國Henry Troemner公司); KQ5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

無水乙醚和無水硫酸鈉(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);乙腈(色譜純,美國Baker公司);試驗室所用水均為去離子水。

10種揮發(fā)性N-亞硝胺混合標準儲備液包括N-亞硝基二甲胺、N-亞硝基乙基甲基胺(N-nitrosoethylmethylamine, NEMA)、NDEA、N-亞硝基二異丙胺(N-nitroso-diisopropylamine, NDiPA)、N-亞硝基二正丙胺(N-nitrosodi-n-propylamine, NDPA)、N-亞硝基二丁胺、N-亞硝基哌啶、N-亞硝基吡咯烷、N-亞硝基嗎啉(N-nitrosomorpholine, Nmor)、N-亞硝基二苯胺(N-nitrosodiphenylamine, NDPhA),質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L,購自美國O2Si公司。

火腿腸、中式香腸和腌漬臘肉等肉制品均采自杭州各大超市,每種肉制品均10批,共計30批樣品,于-20 ℃保存,待測。

1.2 標準溶液的配制

準確吸取10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物各1.0 mL,置于25 mL容量瓶中,用丙酮定容,配制成40.0 mg/L的標準儲備液,于4 ℃冰箱避光保存,有效期6個月;分別移取適量標準儲備液,用丙酮稀釋,配制成10.0 mg/L和1.0 mg/L的混合標準溶液,于4 ℃冰箱避光保存,有效期3個月。

1.3 樣品前處理

1.3.1樣品提取

稱取200 g(精確至0.1 g)樣品,置于1 000 mL圓底燒瓶中,加入少量沸石和100 mL蒸餾水;向三角錐形瓶中加入40 mL無水乙醚,設(shè)置加熱溫度為40 ℃。待樣品溶液沸騰后開始計時,同時蒸餾萃取30.0 min。將無水乙醚萃取物轉(zhuǎn)移至裝有10 g無水硫酸鈉的離心管中,渦旋2.0 min,靜置30.0 min,轉(zhuǎn)移上清液至雞心瓶中,于室溫下氮吹至近干,用乙腈洗滌雞心瓶,將洗滌液轉(zhuǎn)移至5 mL具塞離心管中,用乙腈定容至2.0 mL,密閉,待凈化。

1.3.2樣品凈化

將具塞離心管置于-20 ℃冷凍層中冷凍2.0 h,取出離心管,在4 ℃條件下以8 000 r/min離心3.0 min,過0.22 μm微孔有機濾膜,待氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

1.4 空白基質(zhì)匹配校準溶液的配制

取200 g樣品,置于1 000 mL圓底燒瓶中,加入少量沸石和100 mL蒸餾水,將樣品加熱至微沸狀態(tài)并持續(xù)30.0 min,再按1.3節(jié)方法處理后上機分析,經(jīng)檢測,處理后的樣品中無10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物。將微沸30.0 min處理后的樣品過濾并晾干,作為空白基質(zhì)樣品。

取空白基質(zhì)樣品,按1.3節(jié)方法進行提取凈化,得到空白基質(zhì)溶液。取適量10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物混合標準溶液,用空白基質(zhì)溶液稀釋,配制成1.0、5.0、10.0、50.0、100、500、1 000 μg/L的系列空白基質(zhì)匹配校準溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5 分析條件

1.5.1色譜條件

色譜柱:DB-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度:220 ℃;載氣:高純氦氣;碰撞氣:高純氬氣,純度≥99.999%;柱流量:1.5 mL/min;進樣方式:不分流進樣,1.0 min后開閥;升溫程序:初始溫度36 ℃,保持1.0 min,以8 ℃/min的速率升至150 ℃,以40 ℃/min的速率升至230 ℃,保持6.0 min;進樣量:1.0 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件

離子源:EI源;離子源溫度:230 ℃;電離能量:70 eV;接口溫度:230 ℃;檢測器電壓:1.40 kV;測定方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的保留時間、定性、定量離子和碰撞能量(CE)等參數(shù)見表1。

表 1 10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的分子式、結(jié)構(gòu)式、保留時間、母離子、子離子和碰撞能量

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在EI源模式下對10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物進行一級質(zhì)譜分析(Q3 scan),在質(zhì)譜圖中選擇質(zhì)荷比較大、絕對強度較大的離子作為前體離子;將碰撞能量設(shè)為3～45 eV(每3 eV一個間隔),對選定的前體離子峰進行二級質(zhì)譜分析(產(chǎn)物離子掃描),根據(jù)二級質(zhì)譜圖,選擇離子強度最大的離子作為定量離子,離子強度次之的為定性離子。圖1為10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物在MRM模式下的色譜圖。

圖 1 在MRM模式下10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of 10 volatile N-nitrosamines in multiple reaction monitoring (MRM) mode

2.2 氣相色譜條件的優(yōu)化

分別考察了3種不同極性的毛細管柱(HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、DB-1701(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm))對10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的檢測效果。結(jié)果表明,在MRM分析條件下,3種毛細管柱均可用于10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的分離,但大部分揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物極性較強,尤其是NDMA,即使初始溫度設(shè)置為35 ℃,保持10.0 min, NDMA在DB-5MS和DB-1701毛細管柱中的保留均不好,出峰時間在3.0 min左右,且存在一定程度的峰拖尾現(xiàn)象,不適合準確定量,這與翟孟婷等[25]檢測魚干等材料中8種揮發(fā)性N-亞硝胺化合物時發(fā)現(xiàn)的情況一致;而10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物在DB-WAX毛細管柱中,除NEMA峰形有前伸之外,其余9種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物均響應(yīng)較好。因此選擇DB-WAX極性毛細管柱用于10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的檢測。通過優(yōu)化初始柱溫、流速、升溫速率,使10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物在21 min內(nèi)分離效果較好,且響應(yīng)較高。圖2為10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的總離子流色譜圖。

圖 2 10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物(0.500 mg/L)的 總離子色譜圖Fig. 2 Total ion chromatogram of the 10 volatile N-nitrosamines (0.500 mg/L)

2.3 提取條件優(yōu)化

2.3.1提取時間的考察

圖 3 提取時間對10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物萃取 效果的影響(n=3)Fig. 3 Effect of extraction time on the extraction effects of the 10 volatile N-nitrosamines (n=3)

同時蒸餾萃取是通過對有機溶劑進行加熱，同時對樣品進行加熱并至沸騰狀態(tài)來實現(xiàn)的,該裝置優(yōu)點在于蒸餾和萃取同時進行,只需要少量溶劑就可以提取大量樣品,被檢測組分得到較大程度的濃縮[26]。該方法常對香辛料、肉類、茶葉等樣品進行揮發(fā)性香氣物質(zhì)的提取,為達到香氣物質(zhì)的全面提取,萃取時間常為1.0～2.0 h。為提高實驗效率,本實驗對提取時間進行了考察,SDE萃取時間分別設(shè)置為20.0、30.0、40.0、50.0和60.0 min(見圖3)。當SDE萃取時間為20.0 min時,保留時間靠前的NDMA、NEMA、NDEA、NDiPA、NDPA和NDBA 6種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的回收率低于80.0%,保留時間靠后的NPIP、NPYR、Nmor和NDPhA 4種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的回收率低于60%;當SDE萃取時間延長至30.0 min時,10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的回收率全部達到80.0%以上;當萃取時間繼續(xù)延長時,除NDBA和Nmor的回收率有所降低外,其余揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的回收率均保持穩(wěn)定,可能由于在持續(xù)高溫沸騰過程中,NDBA和Nmor發(fā)生一定程度的降解,導(dǎo)致回收率有所降低。因此,將同時蒸餾萃取時間設(shè)置為30.0 min。

2.3.2凈化效果的考察

由于肉制品中脂肪含量較高,使用蒸餾萃取的方法依然會有大量的脂肪被同時提取出來,在分析過程中,這些酯類物質(zhì)會吸附在進樣口及色譜柱上,從而影響色譜分離和鑒定。根據(jù)目標化合物和脂類物質(zhì)熔點的差異,可利用冷凍的方法將脂類物質(zhì)從提取液中有效分離。本實驗取脂肪含量較高的中式香腸作為實驗樣品,采用1.3.1節(jié)方法提取濃縮后,于-20 ℃分別冷凍0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h,發(fā)現(xiàn)當冷凍小于1.5 h時,有少量白色顆粒物析出;當冷凍時間大于2.0 h時,大量白色顆粒狀的脂類物質(zhì)沉淀于離心管底部,經(jīng)過離心后過膜,待上機樣品由深黃色變?yōu)榈S色。將未經(jīng)冷凍處理空白樣品與經(jīng)過冷凍處理的空白樣品進行Q3 scan分析,由圖4可知,經(jīng)過冷凍處理后的樣品,基線變得干凈平滑,干擾物質(zhì)明顯變少。同時進行回收率試驗,冷凍處理未對10種揮發(fā)性N-亞硝胺化合物的回收率產(chǎn)生明顯變化,說明-20 ℃冷凍2.0 h可有效用于10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的凈化。

圖 4 (a)未經(jīng)冷凍與(b)冷凍處理后空白腌漬臘肉樣品的 總離子色譜圖Fig. 4 Total ion chromatograms of blank pickled bacon samples (a) without and (b) with freezing treatment

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是指樣品中除分析物以外的其他成分對待測物測定值的影響,即非待測組分引起待測物響應(yīng)值增加或減少的現(xiàn)象。本實驗前處理過程用到大量有機試劑,且肉制品基質(zhì)復(fù)雜,可能對目標物的響應(yīng)產(chǎn)生一定影響。本文對基質(zhì)效應(yīng)的考察參照文獻[27]萃取后添加的方法:配制質(zhì)量濃度為0.100 mg/L的10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物標準溶液和空白基質(zhì)匹配校準溶液,在同樣條件下進行分析,根據(jù)公式(1)計算ME,結(jié)果見圖5。

ME=PmPs-1×100% (1)

Y: perk area of the quantitative ion;X: mass concentration, μg/L.

其中,Ps和Pm分別為標準溶液和空白基質(zhì)匹配校準溶液中N-亞硝胺類化合物的響應(yīng)值。當ME=0時,表示沒有基質(zhì)效應(yīng);當ME<0或ME>0時,分別表示存在基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強效應(yīng)。由圖5可知,10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物在肉制品中均存在基質(zhì)增強效應(yīng),在火腿腸中基質(zhì)效應(yīng)比中式香腸和腌漬臘肉中的基質(zhì)效應(yīng)明顯要弱,可能與火腿腸中淀粉含量(一般為5%～30%)較高有關(guān),而中式香腸和腌漬臘肉中脂肪含量較高,在前處理過程中,雖有冷凍凈化步驟,除去大量脂肪成分,但凈化效果依然有限,導(dǎo)致10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物在中式香腸和腌漬臘肉中基質(zhì)增強效應(yīng)明顯。前6種熔沸點較低的揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物基質(zhì)增強效應(yīng)要小于后4種。這可能是因為后4種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物熔沸點較高,在進樣口揮發(fā)時,與較多雜質(zhì)組分共流出,導(dǎo)致其基質(zhì)增強效應(yīng)明顯。在基質(zhì)效應(yīng)存在的情況下,本實驗采用基質(zhì)匹配標準曲線定量,可以在一定程度上降低基質(zhì)效應(yīng)的影響,使定量結(jié)果更加準確。

圖 5 不同基質(zhì)對10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物 基質(zhì)效應(yīng)的影響(n=3)Fig. 5 Effect of different matrices on the matrix effects of the 10 volatile N-nitrosamines (n=3)

2.5 線性關(guān)系、檢出限和定量限

對1.0、5.0、10.0、50.0、100、500和1 000 μg/L的系列空白基質(zhì)匹配校準溶液進行分析,以10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的峰面積為縱坐標、對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線。結(jié)果表明,10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99(見表2)。以定量離子信噪比(S/N)為3和10時的響應(yīng)定義方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ), 10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的檢出限為0.01～0.02 μg/kg,定量限為0.04～0.07 μg/kg。本方法的線性范圍廣,靈敏度高。

2.6 準確度和精密度

按照1.3節(jié)前處理方法,取不含目標化合物的空白基質(zhì)樣品,分別添加不同水平(LOQ水平、1.0和2.0 μg/kg)的10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物標準溶液,通過加標回收試驗考察方法的準確度和精密度,每個添加水平重復(fù)3次,加標回收試驗結(jié)果見表3。結(jié)果表明,10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的平均回收率為74.8%～94.3%,相對標準偏差小于8.3%(n=3),符合GB/T 27404-2008附錄F中對檢測方法確認的要求。

表 3 火腿腸、中式香腸和腌漬臘肉樣品中10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的加標回收率及相對標準偏差(n=3)

2.7 實際樣品的檢測

按本文建立的方法對抽取的10個火腿腸、10個中式香腸和10個腌漬臘肉共計30個樣品進行檢測。結(jié)果表明,6種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物(NDMA、NDEA、NPYR、NPIP、NDBA和NDPA)被檢出(見表4),其中NDMA、NPYR和NDPA的檢出率最高,且有3個中式香腸、5個腌漬臘肉樣品中NDMA含量大于我國GB 2762-2017標準《食品安全國家標準 食品中污染物限量》中的限量值(NDMA≤3 μg/kg)。此外,腌漬臘肉樣品中6種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的檢出值均高于火腿腸、中式香腸樣品,可能與腌漬肉制品獨特的加工工藝有關(guān)[28],較長的加工時間增加了揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物在肉制品中的轉(zhuǎn)化。

表4火腿腸、中式香腸和腌漬臘肉樣品中10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的檢測結(jié)果

Table4Detected results of the10volatileN-nitrosamines in ham sausage, Chinese sausage and pickled bacon

CompoundContents/(μg/kg)Ham sausageChinese sausagePickled baconNDMA0.15-2.960-5.100-7.31NEMANDNDNDNDEA0-3.360-5.400-6.03NDiPANDNDNDNDPA0-1.350-2.820-3.73NDBA0-0.850-1.310-3.21NPIP0-3.420-5.850-7.94NPYR0.3-6.390-7.310-8.46NmorNDNDNDNDPhANDNDND

ND: not detected.

3 結(jié)論

本文采用同時蒸餾萃取法結(jié)合GC-MS/MS對肉制品中10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物進行分析,該方法檢出限低,精密度高,可應(yīng)用于各類肉制品中10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的測定。本研究所建立的方法能夠為揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的檢測提供更多選擇,為評價各類工藝加工的肉制品的安全性提供技術(shù)支持。