復合式提取凈化體系結合超高效液相色譜-串聯質譜法檢測畜禽肉中120種抗生素藥物殘留

卞 華, 秦 宇, 虞成華, 張 凱, 王承平, 林毅侃, 楊保剛, 葛 宇*

(1. 上海市質量監督檢驗技術研究院, 上海 200233; 2. 上海理工大學醫療器械與食品學院, 上海 200093)

獸藥抗生素(veterinary antibiotics)是微生物或高等動植物在生長過程中所產生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產物。其中,主要以抗菌活性強、藥動學優良、選擇特異性突出、臨床效果顯著的喹諾酮類、四環素類、β內酰胺類、大環內酯類、磺胺類和咪唑類等廣譜型抗菌藥為主。這些抗生素在治療和預防動物源性疾病,促進畜禽機體健康生長,以及提高飼料利用效率等方面做出了巨大的貢獻[1]。

抗生素的半衰期不長,但持續過量的抗生素在動物體內大多不被畜禽充分吸收,不完全代謝降解的殘留物對自然生態的破壞和人體機能的紊亂都有著潛移默化的作用和影響[2]。復旦大學重點實驗室,在國際權威雜志《Environment International》上闡述了兒童尿液中抗生素的嚴重性,并認為抗生素的暴露模式可能是促進脂肪生成并導致兒童肥胖的危險因素之一。一直以來,國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission, CAC)的MRL2-2015《食品中獸藥最高殘留限量標準》、歐盟的《Commission Regulation (EU) No37/2010》、美國食品藥品管理局(FDA)的《CFR21食品與藥品聯邦法案》和我國農業部的235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》[3]等都被用來規范食品中抗生素的使用。李雙等[4]對99種獸藥篩查的研究以及于潔等[5]對120種抗微生物藥物的討論,也為抗生素的監控和檢測提供了新的思路。因此,建立一套能同時準確地測定畜禽中多種抗生素殘留的方法非常必要,這對保證食品質量安全具有重要意義。

近些年,超臨界流體萃取技術(supercritical fluid extraction, SFE)、分子印跡技術(molecular imprinting polymer, MIP)、QuEChERS技術等已被報道對抗生素的凈化提取效率有著顯著的效果。張曉光等[6]用在線固相萃取技術結合LC-MS/MS測定了10種大環內酯抗生素, Huertas-Pérez等[7]用QuEChERS技術結合熒光色譜測定了8種磺胺類抗生素、Dorival-García等[8]用超聲波及固相萃取技術結合UPLC-MS/MS來測定牛奶中的喹諾酮類和β內酰胺類抗生素。但抗生素的類別較為廣泛,不同類型的畜禽在不同時期使用的抗生素均不同,優化一套能同時快速測定動物源性食品中的多組分抗生素殘留的分析方法是提高檢測效率的根本需求。

本實驗探究了各類別抗生素的化學結構和極性強弱,通過優化去除水分、蛋白質和脂肪類基質干擾物的前處理方法,建立了一套能夠囊括多類別、多組分殘留的儀器分析方法,以快速確切地鑒別和定量120種抗生素。該高通量篩查方法靈敏度較高,重復性優良,可對畜禽肉中抗生素含量測定標準的制定提供較為可靠的參考依據。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

XEVO TQ-XS三重四極桿串聯質譜儀 (帶電噴霧離子源(ESI))、Acquity UPLC?H-CLASS液相色譜系統(Waters公司);MSZO 204S型電子天平(瑞士Mettler Toleo公司); Centrifuge 5804高速離心機(德國Eppendorf); D-91126多管渦旋振蕩器(德國Heidolph); EZ-2.3 Elite快速溶劑蒸發儀(英國Genevac); Milli-Q超純水系統(美國Millipore)。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷均為色譜純(美國Thermo Fisher Chemical);甲酸(色譜純,美國ACS色譜試劑);乙二胺四乙酸二鈉(國藥集團化學試劑有限公司)。

50 mL管陶瓷均質子、QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管(美國Agilent); Oasis?PRiME HLB(3 mL/60 mg, 美國Waters)。

本實驗所用的標準品純度均≥98%, 24種喹諾酮100 mg/L混合標準溶液、8種抗真菌100 mg/L混合標準溶液;10種青霉素100 mg/L混合標準溶液、20種磺胺100 mg/L混合標準溶液、12種頭孢100 mg/L混合標準溶液、10種大環內酯100 mg/L混合標準溶液、17種咪唑類100 mg/L混合標準溶液、氨芐西林和苯唑西林標準品(美國A ChemTek公司), 9種四環素標準品和10種咪唑類標準品(德國Dr. Ehrenstorfer公司)。

1.2 樣品前處理

1.2.1提取

準確稱取均質后的試樣5.00 g(精確到0.01 g)于50 mL具塞離心管中,加入5.0 mL Na2EDTA-Mcllvain緩沖液與兩粒陶瓷均質子,渦旋3 min至肉呈灰白色糊狀;加入10.0 mL 1.5%(v/v)甲酸乙腈,渦旋3 min,搖床振蕩15 min,加入5 g無水氯化鈉,渦旋2 min,以9 000 r/min離心3 min,收集上清液。殘余物質重復上述甲酸乙腈提取步驟,合并兩次上清液,混合均勻,待凈化。

1.2.2凈化

正己烷液液萃取 將合并后的上清液轉移至快速溶劑蒸發儀中,于45 ℃、10 kPa的條件下,濃縮至干,加入5 mL 25%(v/v)乙腈-水定容液和5 mL正己烷,渦旋2 min,以9 000 r/min離心2 min,取下層液過0.22 μm聚四氟乙烯(poly tetra fluoroethylene,PTFE)濾膜,供UPLC-MS/MS檢測。

Oasis PRiME HLB固相萃取 將合并后的上清液轉移至Oasis PRiME HLB柱中,減壓過濾并保持流速為1～2滴/s,直接收集過濾液,轉移至快速溶劑蒸發儀中,于45 ℃、10 kPa的條件下濃縮至干,加入5 mL 25%(v/v)乙腈-水定容液,渦旋2 min,過0.22 μm PTFE濾膜,供UPLC-MS/MS檢測。

QuEChERS固相萃取 取5.0 mL超純水至QuEChERS dSPE EMR-Lipid管中進行活化,渦旋2 min;將合并后的上清液轉移至其中,渦旋2 min,再依次加入3.0 g鹽析劑無水氯化鈉和3.0 g脫水劑無水硫酸鈉,渦旋2 min,以9 000 r/min離心3 min,取上清液轉移至快速溶劑蒸發儀中,于45 ℃、10 kPa的條件下濃縮至干,加入5 mL 25%(v/v)乙腈-水定容液,渦旋2 min,過0.22 μm PTFE濾膜,供UPLC-MS/MS檢測。

復合式凈化 將合并后的上清液轉移至Oasis PRiME HLB柱中,減壓過濾并保持流速為1～2 滴/s,直接收集過濾液,轉移至快速溶劑蒸發儀中,于45 ℃、10 kPa的條件下濃縮至干,加入5 mL 25%(v/v)乙腈-水定容液,再次加入3 mL正己烷溶液,渦旋3 min,以9 000 r/min離心2 min,取下層液過0.22 μm PTFE濾膜,供UPLC-MS/MS檢測。

1.3 LC-MS/MS分析條件

液相色譜條件:色譜柱Atlantis?T3柱(100 mm×2.1 mm, 3 μm);柱溫40 ℃;樣品室溫度15 ℃;進樣體積2 μL;流動相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液;流動相B:乙腈;流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～1 min, 5%B; 1～16 min, 5%B～75%B; 16～17 min, 75%B～5%B; 17～18 min, 5%B。

質譜條件:電噴霧正離子模式(ESI+),多反應監測(MRM);毛細管壓力: 3.00 kV;椎孔電壓: 40 V;離子源溫度: 150 ℃;脫溶劑氣溫度: 550.0 ℃;脫溶劑氣流速: 1 000 L/h;反吹氣流速: 150 L/h;碰撞氣流速: 0.15 mL/min;霧化氣壓力: 0.7 MPa。120種抗生素的監測離子對(Q1/Q3)、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)見表1。

2 結果與討論

2.1 色譜-質譜條件優化

抗生素多屬于極性化合物,而肉類產品的基質干擾組分主要為脂肪類非極性物質。因此,本實驗選用了在反相色譜條件下對極性化合物分離效果更佳的Waters Atlantis T3色譜柱。Atlantis T3還可以較好地改善普通C18柱對堿性化合物分離不佳,柱壽命短以及堿性分析物與柱填料上殘留硅醇基發生次級作用導致峰形惡化的狀況[9]。

乙腈、甲醇作為2種優良的極性有機溶劑,對于120種抗生素的洗脫能力沒有本質差別。但乙腈需要的柱壓更小,化合物的保留時間更穩定。同時,微量的甲酸可以提供ESI源在Q1四極桿內離子化所需的H+,從而提高離子化效率,得到更好的色譜峰形和更強的靈敏度。因此以0.1%(v/v)的甲酸水溶液和乙腈作為本實驗的流動相。

表 1 120種抗生素的保留時間、母離子、子離子、去簇電壓和碰撞電壓

表 1 (續)

表 1 (續)

表 1 (續)

表 1 (續)

* Quantitative ion.

將配制的質量濃度為1.0 mg/L的8大類混合標準溶液分別依次通過注射泵注入質譜儀中進行參數優化。本實驗的目標化合物均在[M+H]+加合離子模式下采集,分別在Q1和Q3四極桿中優化DP和CE值,并選取相對豐度較高的兩個特征碎片離子為定量和定性離子。所有化合物離子的質譜響應均在106以上,其中喹諾酮、抗真菌、大環內酯和咪唑類化合物的質譜響應強度較為突出,可能是因為這幾類化合物結構中含氮原子,能夠形成穩定的帶電離子[10]。將包含所有化合物(質量濃度為1 mg/L)的混合標準溶液再次注入質譜儀中進行核查,結果表明這120種化合物均能在16 min內得到良好的色譜峰形。8類抗生素代表化合物的色譜圖見圖1。

圖 1 每類抗生素代表化合物在多反映監測模式下的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the representative target in each antibiotics category with MRM mode

2.2 提取溶劑的條件優化

現有的標準與文獻中,甲醇、乙腈和乙酸乙酯常被用來作為目標化合物的提取溶劑。其中,甲醇由于極性過強,提取過程中會帶出較多的雜質,增加后續凈化難度,造成干擾峰過多[11];而乙酸乙酯的極性相對較弱,毒性較低,可作為某幾類化合物(磺胺、咪唑類)合適的提取溶劑,但在120種抗生素的篩查檢測過程中,乙酸乙酯對另外6類化合物的提取效率并不理想;乙腈極性范圍寬,分子小,組織穿透能力強,對糖、脂肪、蛋白質類化合物的沉淀效果較好,同時對多數目標化合物均有較好的溶解性和較高的提取率[12]。另外,酸能破壞基質的細胞組織結構,使目標化合物更充分地被分離出來。微量的有機弱酸還能調節體系的pH值,抑制化合物酸性基團的解離,從而改變目標物在水相-有機相之間的分配比,加強其轉移到乙腈層中的效率。在有機弱酸中,甲酸酸性強于乙酸,本實驗最終以甲酸-乙腈為基礎優化提取條件。

大部分抗生素在pH 4.0到9.0之間穩定,因此,本實驗對提取液中的甲酸體積分數(0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%、5.0%)進行了優化。結果表明,隨著甲酸含量的提升,基質提取液的顏色由透明色漸變成深褐色,說明其對基質的組織結構穿透性越來越強。但當甲酸的體積分數在2.5%以上時,大多數抗生素的回收率顯著下降,在高濃度酸性環境中,其較容易被酸化降解。隨著甲酸體積分數的上升,基質的次級蛋白質結構可能已經發生改變,5%(v/v)甲酸-乙腈溶液體系已不具有很強的流動性(明膠狀態),對后續的凈化過程會造成一定的影響。

圖 2 不同甲酸含量的提取液對抗生素回收率的影響(n=96)Fig. 2 Effect of different formic acid contents on the recoveries of antibiotics (n=96)

喹諾酮、抗真菌和咪唑類抗生素在甲酸的梯度變化中較為穩定,回收率沒有很大的波動,穩定在70%以上(見圖2)。磺胺和大環內酯類抗生素屬于堿性化合物,隨著甲酸體積分數的上升,溶液中的H+更容易造成磺胺類抗生素芳伯氨基結合成配位鍵-NH3+,使其失活,也會促使大環內酯雙環上由羥基與去氧氨基糖縮合成的堿性苷鍵發生水解、內酯開環以及脫酰基反應等,導致其回收率逐漸下降。張科明等[13]在測定豬肉中的獸藥殘留時也發現,當酸度過量時,大部分磺胺類待測物都會發生一定程度的損失,降低提取效率。青霉素類抗生素在酸性條件下的穩定性也較差,易受到親電性和親核性試劑的攻擊,致使其失效。酸性較弱時,其電子轉移引起分子重排,轉變成青霉二酸;酸性較強時,其分子直接裂解,生成青霉胺和青霉醛酸。不過肉類基質中的青霉素類抗生素由純乙腈提取的回收率也并不理想,平均回收率不到50%,因此,適量的甲酸對于青霉素類抗生素的提取是必要的。頭孢類抗生素中的內酰胺環結構相對于青霉素類抗生素更為穩定,但在pH低于2.0時,也較容易分解,其回收率在1.5%(v/v)的甲酸乙腈條件下達到最佳,當甲酸體積分數繼續上升后,因酸化降解回收率顯著下降。值得一提的是,在酸性有機試劑提取條件下,部分藥物回收率出現先增大后減小的趨勢,也可能是因為甲酸量的加大造成藥物離子化程度增加,當超過某臨界點時,其在高比例有機相中的溶解性逐漸減弱[14]。四環素類抗生素較為特殊,其十分容易和蛋白質以及金屬離子配合,只有在偏酸性的環境中才能抑制配合作用。在甲酸體積分數超過1.5%時,四環素類抗生素的回收率均可以提升至70%以上。

據文獻[15]報道,目標化合物在由甲酸乙腈提取之前,需用超純水對樣品進行基質分散,水具有良好的組織滲透性,能分散樣品,渦旋勻漿后能增加溶劑與樣品的接觸面積,防止樣品在乙腈溶劑中緊縮成一團,包裹住目標化合物。本實驗分別考察了5 mL水、Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液以及乙酸乙酯試劑對基質的分散效果,結果發現:乙酸乙酯由于極性低于乙腈,且會降低體系中甲酸的離子化程度,因此不利于大多數目標物的提取,導致喹諾酮、四環素、β內酰胺類和大環內酯類化合物的回收率均有不同程度的下降。相反,Na2EDTA是一種良好的配合劑,不僅能夠有效分散基質,還能競爭性地配合基質中存在的金屬離子,使四環素和部分喹諾酮類化合物游離出來,在Na2EDTA與無機離子螯合釋放出四環素后,利用一些酸化劑來調節體系的pH值可以更進一步地促進四環素的提取效率[16]。另外,Na2EDTA的弱電離性也能促進體系的電離平衡,抑制溶液中的酸性離子對磺胺和大環內酯類化合物的沖擊。

本實驗最終選擇5.0 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液和20 mL 1.5%(v/v)甲酸乙腈作為復合提取溶劑。基質溶液的pH值穩定在4.0左右,滿足大多數抗生素的穩定條件。四環素類抗生素的回收率提升了近25%,在80%以上。磺胺、大環內酯和青霉素類化合物的回收率也分別提升了近15%(見圖3)。(在提取溶劑的優化過程中,均由正己烷凈化,均在同一溶劑標準曲線下校正和比較)。

圖 3 不同基質分散溶液對抗生素回收率的影響(n=96)Fig. 3 Effect of different dispersing solutions on the recoveries of antibiotics (n=96)

2.3 凈化方式的優化

由于肉類樣品的基質較為復雜,選擇合適的凈化方式除去多余雜質從而降低基質效應對于提高目標物的回收率至關重要。本文考察了傳統正己烷液液萃取凈化以及新型的Oasis PRiME HLB柱和QuEChERS粉包的固相萃取凈化效果。結果發現,抗真菌類和咪唑類化合物在3種凈化方式下都較為穩定,但其他類抗生素由QuEChERS凈化后所得的結果要小于另外兩種方法(見圖4),其中喹諾酮和大環內酯類化合物的回收率下降顯著。這可能與QuEChERS粉包的主要成分有機硅烷鍵合硅膠對于喹諾酮和大環內酯含氮雙環結構的影響有關,也可能與QuEChERS粉包難以克服的壁面損失和吸附作用有關。由于獸藥殘留基質復雜,獸藥化學性質各異,QuEChERS對多類別強極性化合物的凈化效果還有待被確認和完善[17]。Oasis PRiME HLB通過式固相萃取柱能有效除去蛋白質、脂肪和磷脂類基質干擾物,相對于普通HLB固相萃取柱,其無需活化、平衡等步驟,操作簡單,耗時更短。結果表明,Oasis PRiME HLB柱與正己烷兩種凈化方式對于目標物的提取效率無明顯差別,前者對于四環素和大環內酯的凈化效果略有優勢,而后者較有利于磺胺和β內酰胺類化合物。本實驗進一步探究了由Oasis PRiME HLB凈化濃縮定容后,再加入3 mL正己烷進行二次除脂,以此復合法凈化后的溶液更為澄清,其回收率要比單一的凈化方式所得的結果提升6%左右(見圖4),部分β內酰胺類目標物的峰形也得到了改善,雜質干擾更少。實驗證明,Oasis PRiME HLB與正己烷的復合凈化方式在獸藥的多類別、多組分殘留分析中更為有效。

圖 4 不同凈化方式對抗生素回收率的影響(n=96)Fig. 4 Effect of different purification methods on the recoveries of antibiotics (n=96) Hexane: liquid-liquid extraction (LLE); PRiME HLB: solid phase extraction (SPE); combined: LLE combined SPE.

2.4 方法學評價

2.4.1基質效應(ME)

由于肉類基質較為復雜,目標化合物經過凈化后仍然會有基質效應存在,需對其影響進行評估。基質效應主要是由于樣品在離子化時基質成分與目標化合物相互競爭電離而導致目標化合物的質譜信號強度有不同程度的增強或減弱。本實驗采用(基質標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率-1)×100%進行評價,負值表示存在基質抑制效應,正值表示存在基質增強效應,絕對值越大則基質效應越強[18]。通常認為,基質效應在±20%內為不顯著[19]。結果表明,部分喹諾酮和咪唑類化合物存在著一定的基質增強作用,肉類基質對于其余抗生素的質譜響應強度均呈抑制狀態。β-內酰胺和大環內酯類抗生素的基質減弱現象較為明顯,其他抗生素均在-17.81%～15.37%之間(見附表1,http://www.chrom-China.com)。為了降低基質效應對質譜靈敏度和重復性產生的影響,提升檢測結果的準確性,實驗采用基質匹配曲線來考察各項方法學參數。

2.4.2線性關系、檢出限與定量限

以陰性空白樣本制備6個水平的空白基質加標溶液,以目標化合物定量離子的峰面積(Y)為縱坐標、質量濃度(X, μg/L)為橫坐標繪制工作曲線。120種抗生素在1.0～ 50.0 μg/L范圍內均線性良好。線性相關系數(r2)在0.995 3～0.999 9之間,其中89種化合物在0.999 0以上。以定量離子信噪比(S/N)=3計算樣品的檢出限(LOD),S/N=10計算定量限(LOQ)。7種化合物的LOQ為10.0 μg/kg, 21種化合物的LOQ為5.0 μg/kg,其余92種化合物的LOQ均不大于2.0 μg/kg (見附表1)。

2.4.3精密度與回收率

取豬、牛、羊、雞空白樣品,添加混合標準溶液,進行96個樣品(4基質×6平行×4批次,為期1個月)的加標回收率測定。120種抗生素的加標回收率平均值在低、中、高3個水平下分別為71.5%～108.8%、72.5%～109.0%和77.7%～109.2%,平均相對標準偏差分別為2.0%～15.3%、1.0%～10.5%和1.1%～4.5%(見表2)。

從表2可以看出,牛肉、雞肉和羊肉的結果較為理想,回收率較高,穩定性較強。豬肉因為脂肪類雜質含量較多,基質效應導致整體回收率偏低5%左右,穩定性也略有浮動,但均滿足食品質量規范技術要求。以上結果說明本方法的準確性和精密度均較為理想,能夠滿足多組分、多類別抗生素的定性篩查和定量檢測要求。

表 2 120種抗生素在3個加標水平下的回收率和相對標準偏差

表 2 (續)

表 2 (續)

All the results shown above are the mean values of 96 samples (n=4(matrixes)×6(parallels)×4(periods)=96).

Levels for antibiotics A, B, E, G and H: low, 2.0 μg/kg; medium, 5.0 μg/kg; high, 10.0 μg/kg. Levels for antibiotics C, D and F: low, 5.0 μg/kg; medium, 10.0 μg/kg; high, 20.0 μg/kg.

2.5 實際樣品檢測

采用所建立的方法,對100批次畜禽產品(豬肉35批次,牛肉25批次,雞肉25批次,羊肉15批次)進行全面的篩查分析。檢出含量較高的有豬肉中的磺胺甲嘧啶(2.97±0.12) μg/kg、恩諾沙星(5.96±0.08) μg/kg;雞肉中的阿苯達唑-2-氨基砜(7.80±0.37) μg/kg;羊肉中的氟康唑(7.89±0.25) μg/kg。為了驗證本方法的可行性和準確性,對陽性樣品分別采用相應的國標方法進行了比較,由GB/T 21316-2007所得出的磺胺甲嘧啶含量為(3.06±0.15) μg/kg,由GB/T 21312-2007所得出的恩諾沙星的含量為(6.19±0.02) μg/kg,由GB 29687-2013所得出的阿苯達唑-2-氨基砜的含量為(7.62±0.22) μg/kg,氟康唑目前沒有相應的國標方法,本文參考張凱等[12]的方法測得氟康唑的含量為(7.62±0.14) μg/kg。由此可見,本實驗方法與其對應的標準方法結果十分接近,并在檢測時間和適用類別上更有優勢,可被用作于獸藥抗生素的定性篩查和定量分析。

3 結論

本文結合肉類基質特點以及8類抗生素的理化性質,對前處理方法進行了開發,對儀器方法進行了優化,建立了一套復合式預處理體系-超高效液相色譜-串聯質譜法,用于同時測定畜禽肉中120種抗生素的殘留。低、中、高3個加標水平下的回收率均在70%～110%之間,且重現性良好,能被用于對畜禽肉中絕大多數獸藥抗生素的快速篩查。該方法在陽性樣品的檢出結果中與傳統標準方法基本吻合,且檢測時間更少,鑒定范圍更廣,對于多類別、多組分的獸藥抗生素的檢測具有較高的參考價值。