多柱色譜技術進展

王曉飛, 孫楷越, 張 博

(廈門大學化學化工學院, 福建 廈門 361005)

色譜技術自20世紀初出現(xiàn)以來,在物質(zhì)分離和純化領域發(fā)揮了重要作用。現(xiàn)今隨著固定相合成工藝的進步和儀器制造技術的發(fā)展,色譜性能得到了顯著的提升。例如亞2 μm和核殼色譜固定相的出現(xiàn),以及耐壓性能更強、死體積更小色譜儀的研制,都顯著提高了液相色譜的分離性能和效率[1-3]。此外,芯片和微流體技術在色譜領域的應用也使色譜分離系統(tǒng)越來越小型化[4-7]。在快速發(fā)展的色譜技術中,同時利用多根色譜柱進行分離分析逐漸得到了關注[8]。在面對批量樣品和復雜生物樣品的分離分析時,傳統(tǒng)的單柱色譜技術往往無法滿足分離能力和分析通量的挑戰(zhàn),而串聯(lián)或并聯(lián)的多柱組合色譜技術則能很好地滿足這樣的需求[8]。例如,在復雜生物樣本分析中,基于多柱的多維分離已廣泛應用于蛋白質(zhì)組學和代謝組學研究[9-11];使用多柱并行分離,一次操作可同時處理數(shù)個樣品,可以顯著提高藥物分析和手性固定相篩選的工作通量[12];此外,基于微流控芯片技術,在芯片上刻蝕多個分離通道,可以實現(xiàn)高通量的微分離分析[13,14](見圖1)。

多柱技術的發(fā)展獲益于色譜柱技術的創(chuàng)新以及分離/檢測接口的改進,多柱色譜分析技術的應用可以更好地解決分離科學所面臨的挑戰(zhàn),例如提高效率、減少消耗和降低環(huán)境污染,這也符合綠色分析化學的原則[15]。在本文中,我們討論了多柱色譜技術的研究及應用,指出多柱技術不僅能夠提高分離性能和效率,還可以為生命科學與生物醫(yī)藥研究提供更深入、更全面的數(shù)據(jù),多柱色譜技術將是未來分離科學發(fā)展的重要方向之一。

圖 1 典型多柱技術應用示例Fig. 1 Typical multi-column chromatography applications

圖 2 典型多維氣相色譜(MDGC)系統(tǒng)配置圖[27]Fig. 2 Typical multidimensional gas chromatography (MDGC) configurations[27] 1D: first-dimension column; 2D: second-dimension column; ΔP: pneumatic control; INJ: injector; DET: universal, specific or mass-selective detector or infrared spectroscopy.

1 多維色譜系統(tǒng)中的多柱技術

為了獲得更大的峰容量和更高的分離效率,多維色譜系統(tǒng)多數(shù)由一系列不同且相對獨立的正交色譜分離系統(tǒng)組成,包括二維氣相色譜(GC×GC)、二維液相色譜(LC×LC)和二維液相色譜氣相色譜混合系統(tǒng)(LC×GC)。多維色譜至少需要兩根色譜柱,是典型的多柱技術應用形式,已被廣泛應用于科研與生產(chǎn)中。

1.1 多維氣相色譜系統(tǒng)

圖 3 二維陣列毛細管液相色譜系統(tǒng)[39]Fig. 3 Two-dimensional capillary arrayliquidchromatography system[39] a. Schematic diagram of column array-based 2D-LC system; b. post-column micro valve at open state; c. post-column micro valve at close state.

基于兩根分離性能正交的氣相色譜柱構建GC×GC系統(tǒng)(見圖2),可使分辨率、靈敏度都得到數(shù)倍增加。GC×GC系統(tǒng)可以提供復雜揮發(fā)性樣品的更豐富的成分信息[16],因此在天然產(chǎn)物、石油化工和煙草等成分復雜樣品的分析中,GC×GC平臺得到了廣泛應用[17-24]。在每一維分離中,色譜柱長度、直徑和固定相種類的選擇是決定GC×GC分離性能的關鍵因素[25-27]。除了柱型的選擇,多維分離系統(tǒng)間的接口是影響GC×GC發(fā)展與應用的另一個關鍵技術,接口技術與色譜柱中載氣的壓力和速度密切相關,進而影響到色譜系統(tǒng)的分離能力。Khan等[16]設計了一種全二維氣相色譜系統(tǒng),通過改善接口,引入了第二維壓力調(diào)諧系統(tǒng),并證明通過第二維的壓力調(diào)諧,可以調(diào)控極性和非極性化合物在第二維分離系統(tǒng)中的出峰位置。Yan等[28]設計了一種全新的并行全二維氣相色譜系統(tǒng)(2GC×2GC),它整合了兩個相對獨立的二維柱系統(tǒng),通過反向熱調(diào)制(contra-directional thermal modulation)控制兩個GC×GC分離系統(tǒng),使峰容量比單個GC×GC系統(tǒng)加倍,并對啤酒花精油中的復雜成分進行分析。結果表明,基于4種正交分離性能的色譜柱,2GC×2GC可提供全面互補的化合物信息。隨著新型接口和分析策略的研制和發(fā)展,基于不同選擇性柱型的多維GC系統(tǒng)將為復雜揮發(fā)性樣品的分析提供更多物質(zhì)信息。

1.2 多維液相色譜系統(tǒng)

在二維液相色譜系統(tǒng)(LC×LC)的操作過程中,第一維色譜分離后,各個組分經(jīng)過濃縮、捕集或分流后分別進入第二維分離系統(tǒng)進一步分離;與一維液相色譜系統(tǒng)相比,二維液相色譜系統(tǒng)具有更高的峰容量和分離度[29],近年來在復雜體系的分離中得到了廣泛應用,如蛋白質(zhì)分離分析[30,31]、代謝組學分析[32]、中藥成分分析[33,34]和生物樣品中農(nóng)獸藥殘留檢測[35]等。二維液相色譜有離線分離和在線分離兩種分析策略,離線二維分離具有更廣的溶劑選擇、成本低和峰容量大等優(yōu)勢[34],不受流動相兼容性的約束[33],在線分離則需要解決不同分離維度間流動相與流速的兼容性等挑戰(zhàn)[36]。

但隨著全二維液相色譜概念的提出,以及方法學[37]、系統(tǒng)控制[35]和微加工技術[38]的改進,全多維液相色譜技術彌補了傳統(tǒng)技術的不足,得到了迅速發(fā)展,并已廣泛應用于生命科學、環(huán)境科學等領域。相對于多維氣相色譜,多維液相色譜系統(tǒng)有更多不同分離機理的色譜柱可供選擇,如離子交換色譜(IEC)、反相色譜(RPLC)、親和色譜(AC)、尺寸排阻色譜(SEC)和正相色譜(NP)等,通過構建豐富多樣的多維正交分離系統(tǒng),可以實現(xiàn)特定的分離目的。Liu等[39]建立了二維毛細管陣列LC×LC系統(tǒng),包含一根強陽離子交換毛細管柱(SCX)作為第一維分離系統(tǒng)、10個微型三通閥和10根反相毛細管柱(RPLC)陣列作為第二維分離系統(tǒng),結合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜(MALDI)檢測,從肝癌組織中檢測到數(shù)千種多肽,并鑒定出1 202種蛋白質(zhì)(見圖3)。LC×LC系統(tǒng)也廣泛應用于復雜基質(zhì)樣品的分離檢測,Zeng等[40]成功構建了多通道二維色譜系統(tǒng),并通過分離純化藍莓提取物中的生物活性物質(zhì)驗證了其分離能力;LC×LC分離也應用于聚合物中單/雙官能團物質(zhì)檢測,基于這些信息可以更準確地判斷聚合物的功能特性[41]。基于多柱策略的多維色譜法已越來越多地受到分析人員的青睞,并廣泛應用于諸多研究領域中復雜樣品的分離分析。隨著接口技術和檢測技術的發(fā)展和成熟,多維色譜法將得到更為廣泛的應用。

2 芯片色譜中的多柱技術

基于芯片的微型色譜分離系統(tǒng)可以減少樣品和試劑消耗,并且還大幅減少了分析時間和成本[42],因此已成為新興的研究方向[43-46]。隨著微流控技術、微加工技術的發(fā)展和改進,基于芯片的多柱技術也得到了發(fā)展和應用。

芯片液相色譜發(fā)展相對較慢,這主要是因為難以在芯片微通道內(nèi)構建穩(wěn)定均一的柱床。而采用通道表面涂覆[47,48]、原位整體柱[49,50]技術的芯片色譜系統(tǒng),其分離性能和樣品負載量又遠小于顆粒填充柱床系統(tǒng)[45]。Nagy等[51]報道了一種多通道液相色譜芯片的簡單制造方法,該方法采用無柱塞技術,在芯片通道內(nèi)填充了常規(guī)色譜固定相顆粒,單個芯片上可以同時制備3～12個平行的色譜分離柱,從而獲得了較高的樣品分析通量。Huang等[52]構建了基于納米銀-氧化石墨烯(Ag/GO)納米材料的陣列式多通道玻璃芯片前處理裝置,并結合HPLC-FLD法同時對草魚中的雙酚A(BPA)和壬基酚(NP)進行痕量檢測,BPA和NP分別可以達到113和92倍的富集。這一基于芯片的陣列色譜柱可以重復使用至少15次,且該方法的檢出限顯著降低。Shintani等[53]報道了一種小型化多通道高效液相色譜系統(tǒng),包括單個高壓梯度泵、基于芯片的樣品進樣單元、單片硅膠毛細管柱陣列和基于光纖的多通道UV檢測單元。該系統(tǒng)可同時分離檢測多個樣品,并可獲得高重現(xiàn)性的分離效果(RSD<0.9%),在組學分析和組合化學中有應用潛力。為了解決芯片通道內(nèi)柱床填充均一度的問題,Huft等[54]提出了一種低壓顆粒柱床填充技術:在分離通道旁開出微米尺寸的旁路通道,實現(xiàn)高質(zhì)量柱床快速填充。此技術為芯片多柱填充提供了新的解決方案。基于此技術,Huft等[55]繼而開發(fā)出了并行多柱的芯片HPLC系統(tǒng),可以實現(xiàn)自動樣品加載、梯度生成、分離、熒光檢測和樣品回收等步驟。Nagy等[56]通過COMSOL Multiphysics軟件模擬多柱并行芯片色譜系統(tǒng)中的壓力和速度分布,找到最優(yōu)的通道幾何形狀和壓力條件,并使用12道并行芯片色譜系統(tǒng)驗證了模擬結果。這種方法大大縮短了復雜幾何形狀多柱芯片色譜系統(tǒng)的設計和制作時間(見圖4)。與傳統(tǒng)色譜儀器相比,芯片色譜系統(tǒng)需要更高的加工精密度和集成度、更高的信噪比、更快的響應和更小的檢測尺寸,因而對微加工技術提出了更高要求。同時,隨著微納分析技術的發(fā)展,多柱芯片色譜系統(tǒng)除滿足常規(guī)化學分離外,在不久的將來還有望實現(xiàn)化學反應、樣品前處理、篩選和后處理等多級單元操作的集成。

圖 4 基于芯片的多柱色譜分離系統(tǒng)[56]Fig. 4 Multi-column chromatographic separations on microchip[56] (a) Photographic and (b) schematic representation of the microchip with 12 parallel C18 packings (0.1 mm×0.03 mm×10 mm, as width×height×length).

3 多柱毛細管電泳技術

毛細管電泳(CE)又稱高效毛細管電泳(HPCE),以毛細管作為分離通道,由高壓直流電場驅動,廣泛應用于生物大分子的分離,如蛋白質(zhì)分析和DNA測序。在高通量測序方法出現(xiàn)之前,DNA測序是一個繁瑣的過程[57]。20世紀90年代早期研制出毛細管陣列電泳和配套的檢測系統(tǒng)[58-62],第一代商品化96道毛細管電泳測序儀在1998年出現(xiàn),如GE Healthcare MegaBACE 1000和ABI Prism 3700 DNA分析儀[57]。多柱陣列CE提高了DNA測序的效率,降低了測序成本,并實現(xiàn)了自動化,可以輕松實現(xiàn)DNA的高通量測序(見圖5)。

多柱CE技術也被用于目標分析物的富集以提高檢測靈敏度。Britz-Mckibbin等[63]描述了基于96通道毛細管陣列電泳和紫外檢測的嘌呤代謝物富集和檢測系統(tǒng),該系統(tǒng)具有高靈敏度和高通量的特性。在Cheng等[64]的研究中,以2～20根并行毛細管電泳陣列對樣品中汞離子(Hg2+)和甲基汞(MeHg)進行富集和分離,顯著降低了目標物的檢出限;他們指出,通過使用并行毛細管電泳陣列可以提高靈敏度,且靈敏度的提高與分離柱數(shù)成正比,同時分離效率和分辨率不受平行多柱的影響。

多柱毛細管電泳系統(tǒng)具有一系列優(yōu)勢。其由高壓直流電場驅動，且無需使用固定相顆粒填充柱床,更容易實現(xiàn)多柱聯(lián)用而無需考慮柱型和輸液系統(tǒng)。基于以上因素,多柱CE系統(tǒng)已逐漸成熟并商業(yè)化,并已為生命科學研究做出了顯著的貢獻。

圖 5 雙色共焦熒光毛細管陣列掃描儀的示意圖[59]Fig. 5 Schematic of the two-color, confocal-fluorescence capillary array scanner[59]

4 高通量手性固定相的篩選

手性色譜是目前使用最廣泛的拆分對映體的方法[65],目前約有1 300種手性色譜固定相(CSP),其中約170種已經(jīng)商品化[66],并不斷有新型CSP被開發(fā)應用。為了滿足新型手性化合物分離分析的需求,開發(fā)快速的CSP篩選方法非常重要。通過使用短柱和提高柱效縮短單次分離時間[67,68]、單次運行多次進樣[69,70]、快速超臨界流體梯度[71,72]和平行多柱篩選[73]均能有效提高分析通量。

圖 6 帶有圓二色光譜檢測器的5柱并行篩選HPLC系統(tǒng)[77]Fig. 6 Customized HPLC system for five-column parallel screening with circular dichroism (CD) signal pooling[77]

通過色譜柱的序列自動切換進行篩選是一種廣泛使用的策略[74,75],但這種方法一次只能測試一種流動相條件。為了提高篩選效率,多柱切換和平行柱篩選方法已經(jīng)廣泛應用并可以提供更準確、更快速的結果[76]。如AB Sciex公司的Eksigent Express LC系統(tǒng)、Sepiatec公司的Sepmatix系統(tǒng)都能夠提供8柱并行的篩選容量。這些并行多柱篩選系統(tǒng)可以顯著縮短方法開發(fā)的時間,并減少溶劑消耗量。Zhang等[77]開發(fā)了一種快速手性柱篩選的新策略,它基于多柱平行分離篩選和圓二色(CD)檢測器,集成了一個HPLC自動進樣器、一個輸液泵、5個并行手性柱和5個紫外檢測器,可以同時對5種手性柱進行篩選,包括Chiralpak AD、Chiralpak AS、Chiralcel OJ、Chiralcel OD、Whelk-O1手性色譜柱。與廣泛使用的順序柱切換方法相比,該系統(tǒng)的篩選速度提高了5倍(見圖6)。同樣,Wang等[78]提出了一種針對3種不同手性色譜柱的篩選方法,這些色譜柱分別填充了具有互補選擇性的大環(huán)糖肽手性固定相;作者研究了偶聯(lián)柱的保留性和選擇性,并與單個或多種混合手性固定相進行了比較。

需要指出,基于多柱并行篩選策略只需幾個小時即可完成固定相篩選,而傳統(tǒng)的順序篩選方法往往需要數(shù)天才能選出理想的固定相。多柱并行HPLC方法的自動篩選策略將顯著提高生物醫(yī)藥等領域對映體拆分的效率。

5 高通量分離純化技術

面對樣本數(shù)量巨大的分析任務時,發(fā)展高通量技術成為必然[79,80]。通過加大流動相流速、使用粒徑更小的填料和長度更短的色譜柱可以實現(xiàn)快速分離,但這都是以增加背壓和降低進樣量為代價的;另一種提高分離通量的方法是使用多柱技術[81,82]。面向制藥工業(yè)對高通量分析的需求[83],市面上已有Eksigent Express 8008通道和NanostreamVeloce 24通道液相色譜系統(tǒng),能夠在使用多根不同固定相的色譜柱時,執(zhí)行快速的梯度分離[84,85]。

Gross等[86]報道了基于雙柱的平行HPLC系統(tǒng),單次進樣后將樣品送入兩根色譜柱,使用不同的洗脫條件和單個多波長檢測器檢測,通過分析芳香族化合物對該平行柱系統(tǒng)進行了測試;結果表明,與傳統(tǒng)的單柱方法相比,該系統(tǒng)可獲得更高的分離選擇性和定量精度,使用傳統(tǒng)單柱方法分析8種目標物(苯甲醚、苯、苯甲酰胺、氯苯、乙苯、間甲酚、鄰甲酚和甲苯)時,在ZirChrom PBD和CARB兩種固定相色譜柱中均存在顯著出峰重疊,但當以雙柱平行方式使用相同兩種固定相色譜柱進行分析定量時,能夠實現(xiàn)較高的定量精度(通常RSD=2%)。在另一項研究[87]中,通過在等度洗脫條件下分離15種磺胺類藥物,考察串聯(lián)和平行多柱技術的性能,并指出多柱串聯(lián)技術優(yōu)于平行多柱技術。

在純化工藝中,多柱技術也有廣泛的應用,這些多柱技術可以分為連續(xù)、半連續(xù)過程[88-90]。多柱純化系統(tǒng)操作中通常有許多變量,因此方法優(yōu)化變得相當復雜。因此,進化算法(evolutionary algorithm)等先進的優(yōu)化技術也被應用于多柱色譜純化過程開發(fā)中[91]。Heinonen等[92]設計了一種內(nèi)部循環(huán)的4柱平行純化工藝,并以木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物的分離純化驗證了模型,不僅實現(xiàn)電解質(zhì)和非電解質(zhì)的同步分離,還獲得了優(yōu)良的分離性能:硫酸的回收率和純度分別達到98%和94%,單糖為85%和95%,乙酸為88%和93%;該純化方法不僅單糖產(chǎn)率高,洗脫液消耗量是單柱平行分批純化法的1/20。

光學檢測器由于具有多通道檢測容量,已在大多數(shù)多柱色譜中廣泛采用;而質(zhì)譜檢測器由于其在定性和定量方面的雙重優(yōu)勢,也被嘗試應用于多柱色譜系統(tǒng)中。在復雜生物樣本的分析中,通過使用兩個集成的LC單元(每個單元帶有自動進樣器和輸液泵組件),可以充分利用色譜柱的平衡時間來提高質(zhì)譜儀的檢測通量和使用效率[93]。該分析策略也被用于基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學研究中,可以消除色譜柱的再生/平衡時間延遲,使分析通量提高一倍[94]。基于此分析策略,Livesay等[95]進一步引入了4個平行色譜柱,這種自動化四柱系統(tǒng)在所考察的液相色譜條件下的使用覆蓋率接近100%,顯著提高了質(zhì)譜檢測器的利用率。

另一種提高質(zhì)譜檢測通量的方法是使用多個噴霧針的離子化系統(tǒng),該方法可以同時獲得每支并行色譜柱的數(shù)據(jù),從而實現(xiàn)在單次色譜運行時間內(nèi)同時分析多個樣品[96](見圖7)。基于此分析策略,Yang等[97]在HPLC系統(tǒng)中并聯(lián)4個分析柱,同時在三重四極桿質(zhì)譜儀上連接四通道的多路電噴霧接口(MUX),同時在4種不同的生物基質(zhì)中檢測并測定氯雷他定及其代謝物,結果符合美國食品和藥物管理局(FDA)驗收標準的精度和準確度。后續(xù)的工作中,該小組[98]還進一步構建了并聯(lián)8柱液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測-質(zhì)譜(LC-ELSD-MS)系統(tǒng),由LCT飛行時間質(zhì)譜儀和八通道多路電噴霧接口組成,可用于天然產(chǎn)物庫的建立與表征,為制藥工業(yè)和天然產(chǎn)物研究提供了高通量篩選的有力工具。并行多柱策略可以顯著提高分離分析和制備純化的通量,多柱技術的發(fā)展和多通道質(zhì)譜檢測接口的創(chuàng)新都將大大擴展多柱色譜的應用領域。

圖 7 四通道LC-MS接口整體系統(tǒng)布局[96]Fig. 7 Overall system layout for the four-way multiplexed LC-MS interface[96]

6 串聯(lián)多柱色譜技術

通過多柱的串聯(lián)耦合來調(diào)節(jié)固定相種類與組成是提高色譜分離度的相對簡單的解決方案。該方法使用兼容的洗脫條件和常規(guī)儀器,可以在不同類型的色譜柱上實施[99]。串聯(lián)耦合柱(SCC)液相色譜系統(tǒng)僅需配備單個泵系統(tǒng)和單個檢測器,且在柱與柱之間不需要任何裝置來存儲洗脫液,因而儀器結構簡單、易于實現(xiàn)。同時,在等度洗脫模式下,不同選擇性的色譜柱可以產(chǎn)生一定的梯度效應,能夠顯著縮短分析時間,這一優(yōu)勢在復雜混合物的分離分析中也得到了證實[100-111]。

降低色譜柱直徑是提高分析靈敏度的常用方法,但內(nèi)徑減小會限制上樣量,進而會限制靈敏度的增加,串聯(lián)耦合內(nèi)徑逐漸減小的色譜柱則可彌補這個不足。de Vries等[112]設計了一個四柱串聯(lián)且內(nèi)徑逐漸減小(2.1、1.0、0.5、0.15 mm逐級遞減)的柱系統(tǒng);注射80 μL血漿,同時分析咪達唑侖和1′-羥基咪達唑侖,以此對該裝置進行評價,結果表明其具有穩(wěn)健的分離性能;與經(jīng)典的捕集-洗脫法相比,靈敏度提高了10～50倍;與直接micro-UHPLC方法相比,靈敏度提高了250～500倍。

7 結論與展望

作為一種新穎的分離分析策略,多柱色譜技術可以解決復雜基質(zhì)分析、大批量樣品分析和手性固定相篩選等分析難題。與傳統(tǒng)的單通道色譜不同,多柱色譜系統(tǒng)通常需要一個穩(wěn)定的多通道流動相輸送系統(tǒng),以控制每個色譜柱中流動相的參數(shù),如速率、成分和溫度。然而目前常見的兩種方案,即分流策略和多泵驅動策略,往往占用較大空間,且不能滿足穩(wěn)定性的需求。實現(xiàn)穩(wěn)定的多通道流動相輸送是多柱色譜技術發(fā)展的主要挑戰(zhàn)。

另一方面,多柱色譜中使用的色譜柱應具有良好的重現(xiàn)性,如穩(wěn)定的背壓和分離度。基于當前的色譜柱制造工藝,即便使用相同生產(chǎn)批次的色譜柱,也會存在柱間差異,而從大量色譜柱中挑選性能一致的色譜柱并非易事。因此,開發(fā)快速、成本低和性能穩(wěn)定一致的制柱技術是重要且緊迫的任務。

盡管多通道光學探測器已經(jīng)成熟,但它們的同步定性和定量能力弱于質(zhì)譜檢測器。目前,多通道質(zhì)譜檢測方法仍處于起步階段。因此,發(fā)展新型多通道質(zhì)譜檢測器和檢測策略,將顯著支撐和推進多柱色譜技術的發(fā)展和應用。