透明質酸鋅的合成及在小鼠創面修復中的應用

張海娟，章琪露，徐穎，徐莉菲，金柳君，許可

（1.溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035；2.溫州大學 生命科學研究院，浙江 溫州 325035）

皮膚損傷是臨床上的常見病與多發病，而透明質酸在體內主要發揮維持細胞外基質環境以及細胞修復等功能[1]。近年研究發現透明質酸具有良好的生物相容性以及在創面愈合中的生物活性等，逐漸應用于創面敷料或組織工程等領域[2]。鋅劑具有較強的皮膚收斂和殺菌作用，因此將透明質酸與鋅結合[3]，但目前國內并無相關品牌，且我國相關基礎研究較少。本研究對透明質酸鋅制備工藝進行相關改進，并對其理化性質進行鑒定，對其創面愈合效果進行研究。

1 材料和方法

1.1 材料 取SPF小鼠10只，雌雄各半，體質量（20±5）g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（浙）2015-0009。透明質酸鈉購于山東福瑞達醫藥集團股份有限公司，氯化鋅購于汕頭西隴科學有限公司，氯化鈉購于天津科密歐化學試劑有限公司，胰化蛋白胨及酵母提取物均購于英國OXOID公司。鈉離子儀購于杭州齊威儀器有限公司，原子吸收光譜儀購于美國Thermo公司。

1.2 透明質酸鋅合成方法 稱取0.15 mol/L氯化鋅溶液，靜置0.5 h后取上清（約為0.1 mol/L），然后逐滴加到透明質酸鈉溶液中（0.25 g溶于25 mL蒸餾水）；同時用鈉離子儀檢測溶液鈉離子濃度，記錄數據：當儀器數值穩定后，補蒸餾水到50 mL，得到0.5%透明質酸鋅溶液。

1.3 原子吸收法檢測金屬元素含量 將透明質酸鈉和氯化鋅溶液反應過夜后，3 000目透析袋透析1周，期間每隔12 h換一次水，然后取出放置在-80 ℃ 冷凍過夜，再放入真空干燥機24 h以上，待完全凍干后取出。稱取凍干后的透明質酸鋅稀釋成一定濃度溶液，然后用原子吸收光譜儀檢測溶液中鈉元素和鋅元素的含量。

1.4 透明質酸鋅抗菌性能檢測 將大腸桿菌用LB液體培養基培養3～4 h后，分別配制0.5%透明質酸鈉溶液，0.5%透明質酸鋅溶液，以及pH 5.5的枸櫞酸溶液（對照組），取一定量大腸桿菌溶液，加入到上述溶液中混合培養1～3 h，然后取上述混合液100 μL到LB固體培養基中，37 ℃培養24 h，取出計算菌落數。

1.5 動物創面修復實驗 取10只健康小白鼠，雌雄各半，制備小鼠全層皮膚切除模型，利用八針法將墊圈縫在老鼠背部兩側，傷口對稱，然后分別涂上透明質酸鋅溶液（0.5%）和透明質酸鈉溶液（0.5%），待液體干了之后用繃帶將傷口包上，傷口每天涂抹2次，每隔數天拍照記錄創面面積。見圖1。

圖1 小鼠全層皮膚切除模型

1.6 統計學處理方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計分析。計量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 透明質酸鋅的合成 利用鈉離子檢測儀檢測溶液中鈉離子濃度，當鈉離子濃度儀數值不再變化時，停止添加氯化鋅溶液。隨著氯化鋅含量逐漸升高，儀器數值逐漸升高，當添加量約為6.25 mL，反應達到平衡（見圖2）。若透明質酸鈉完全解離，計算可得反應達平衡時氯化鋅添加的理論值應為6.00 mL， 排除實驗誤差，理論值和實際值接近。

圖2 氯化鋅添加量與鈉離子濃度的關系

2.2 透明質酸鋅性質鑒定 本研究將生產的透明質酸鋅溶液進行透析和凍干，然后利用元素分析檢測所 含鋅離子和鈉離子含量。經稀釋后透明質酸鈉中鈉離子濃度為0.269 mg/L，鋅離子濃度為0.004 mg/mL， 而透明質酸鋅中鈉離子濃度為0.290 mg/mL，鋅離子濃度為0.024 mg/mL。透明質酸鈉轉化為透明質酸鋅過程中，1個鋅離子取代2個鈉離子，鈉離子分子量為23，鋅離子分子量為65.5；根據元素分析儀所測結果及物質的量換算表明取代下來的鈉離子與結合上去的鋅離子摩爾比為2:0.9；排除實驗誤差，接近理論值的2比1。見圖3。

圖3 干燥后透明質酸鋅粉末

2.3 透明質酸鋅抑菌實驗 有研究敘述了透明質酸鋅具備抗菌性能[4]，但是未做深入研究。本研究透 明質酸鋅溶液pH值為5.3左右，因此需要設相同的pH組來驗證抑菌效果。由于起始細菌數過高，透明質 酸鈉溶液組（pH 6.8）和對照組（pH 5.5）未表現出明 顯差距（1 cm×1 cm）；與透明質酸鈉溶液和緩沖溶液相比，透明質酸鋅溶液抑菌效果更好，見圖4和5。2.4 透明質酸鋅促創面修復 透明質酸鋅的促愈合效果好于透明質酸鈉。在第12天和第15天2組創面面積差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6-7。

圖4 不同溶液的抑菌效果

圖5 不同溶液對應細菌菌落數比較

3 討論

創面是正常皮膚或組織在外界致傷因子以及機體內在因素如局部血液供應障礙等作用下所導致的損害。常伴有皮膚完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失，同時還有可能使皮膚的正常功能受 損[5]。創面損傷愈合包括血液凝固、炎癥反應、血管發生、纖維組織形成、上皮化、創面收縮、塑形，是一個多因素參與的復雜而精細的生物學過程[6]。當多種因素造成皮膚愈合不良、形成瘢痕時，不僅影響患者的美觀，還可導致患者肢體功能障礙，甚至危及生命。研究發現在創面愈合過程中，細胞外基質起到重要作用，它可以為細胞提供移動的網絡和向導，把細胞黏附在一起，對組織的愈合起到骨架作用，并且影響各種生長因子生物活性及其調節作用[7]。膠原蛋白與透明質酸是細胞外基質的主要成分，膠原蛋白在修復上的臨床應用已經較為普遍，不少研究發現透明質酸因在無瘢痕愈合方面有明顯作用而受到人們越來越廣泛的關注[8]。 透明質酸及其鹽是廣泛存在于人體內的生理活性物質，由葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖組成的雙糖單位連接而成的一種高分子黏多糖。其中透明質酸鈉臨床應用較多[9]，在皮膚損傷實驗中抗感染是至關重要的一環，但透明質酸鈉在此方面較為欠缺。鋅被稱為“生命元素”，它是所有生物系統必需的微量元素，也是人體必需的14種微量元素之一[10]。研究發現，改善全身或創面局部鋅營養狀態可促進不同類型的創面修復[11]，此外鋅劑具有較強的皮膚收斂和殺菌作用，對外科手術及創面感染有一定的療效，不少研究也發現鋅是一種安全性很好的抗菌金屬物質[12]。臨床用藥爐甘石其有效成分就是碳酸鋅和氧化鋅，其作用是保護和收斂皮膚[13]。鋅離子還可以作為透明質酸鈉的陽離子替代物增加治療效果，透明質酸鋅已經被證實是一種新型復合物[14]， 因此將透明質酸與鋅結合，能更好地發揮協同促創面愈合的作用。但透明質酸鋅目前國內沒有相關產品、原料等，我國市場主要是被匈牙利吉瑞大藥廠所生產的愈膚欣醫用透明質酸鋅凝膠占據，并且我國相關基礎研究還較少[15]。BURGER等[4]發現透明質酸鈉不完全解離，但在鋅離子作用下，原來與透明質酸鹽鍵合的鈉離子能釋出，并且隨著鋅離子濃度增加，鈉離子釋出也增多，當等當量的鋅離子與透明質酸鈉反應時，鈉離子就能完全釋出。本研究通過測得透明質酸鈉與氯化鋅反應后鈉離子濃度的趨勢變化并計算出完全反應氯化鋅的理論添加值6.00 mL與實際值6.25 mL接近（見圖2），證明透明質酸鈉完全電離，且該反應為完全反應。匈牙利專利[16]報道了粉末狀透明質酸鋅的制備工藝：將透明質酸鈉溶于水，加入鋅鹽后用有機溶劑沉淀，再用有機溶劑脫水干燥。此法簡單快速，但是鹽離子較多。目前國內外采用的是離子交換樹脂法，占用設備多，操作較復雜，價格昂貴，因此限制了透明質酸鋅的臨床應用[17-18]。有研究報道說透明質酸與鋅更多的是通過共價鍵形式連接[19]，本研究也對透明質酸鋅該性質進行了鑒定，這提示我們可以通過控制氯化鋅的添加量，使反應雜質達到最低，而透析則利用相對分子質量大小差異將透明質酸鋅與雜質進行分離。參考該報道并針對兩者工藝的缺陷，本研究通過改進傳統的離子交換法，運用透析的方法，去除生成的氯化鈉等小分子，制備出純度較高的透明質酸鋅，根據實驗結果我們推測透明質酸與鋅是以共價鍵的形式連接，并且在抑菌實驗中可見透明質酸鋅的抑菌能力明顯強于透明質酸鈉。本研究通過小鼠全皮切除創面實驗來比較透明質酸鈉和透明質酸鋅促進創面愈合效果，結果表明透明質酸鋅組的小鼠傷口愈合比透明質酸鈉組更快，證明透明質酸鋅具有協調促修復作用。但本實驗還缺乏對透明質酸鋅促進創面修復的機制研究，如是否對于血管損傷有影響或是否在促進某種蛋白質的增加等，因此接下來我們將重點研究其分子機制。

圖6 不同時間點創面連續愈合情況

圖7 不同時間點創面面積大小