漢黃芩素對急性肺損傷小鼠的保護作用

葛金林，余雯文，曾余豐，金晨慈，戴元榮

（1.溫州醫科大學附屬第二醫院 呼吸內科，浙江 溫州 325027；2.溫州市中西醫結合醫院 呼吸內科，浙江 溫州 325000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是一種由創傷、輸血、感染等多種因素所導致的急性進行性呼吸功能不全或呼吸衰竭癥狀，有較高的發病率和病死率[1]。由于ALI確切的發病機制不明，因此臨床上尚缺乏有效的針對ALI的治療方法。目前，有研究證明包括黃芩在內的多種中藥在ALI的動物模型中，對肺損傷有治療效果，但其準確藥理成分及涉及的分子機制尚不明確。漢黃芩素（wogonin，WOG）作為黃芩的主要藥理成分之一，已被證明可在結腸炎及皮膚炎癥等動物模型中通過抑制一氧化氮、前列腺素E2等的產生減輕炎癥反應[2-4]。但缺乏足夠的研究證明WOG對ALI的治療效果。因此，本研究利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）在小鼠中誘導ALI模型，并予以WOG治療，觀察小鼠肺部損傷改善程度及相關炎癥指標變化，以期為WOG治療ALI的臨床應用提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑 C57/BL6（SPF級，雄性，6～8周齡）小鼠，購于上海南方模式生物研究中心，許可證號：SYXK（滬）2017-0012。LPS和WOG購于美國Sigma公司；流式抗體anti-CD11b-APC、anti-Gr-1-FITC和anti-F4/80-FITC購于英國BD公司；TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA試劑盒，購于深圳達科為生物科技有限公司；蛋白印跡相關抗體購于美國Abcam公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術研究所。

1.2 動物分組及ALI模型建立 隨機將C57/BL6小鼠分為空白對照組（Control組）、LPS誘導的ALI組（LPS組）、WOG治療組（WOG組），每組10只。各組處理方法如下：Control組和LPS組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液50 μL；WOG組腹腔注射WOG 5 mg/kg。LPS組和WOG組腹腔給藥1 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉 （50 mg/kg）麻醉小鼠，經鼻腔滴注LPS（1 μg/kg，每只50 μL），構建小鼠ALI模型，Control組麻醉鼻腔滴注相同體積0.9%氯化鈉溶液。

1.3 模型構建結果及藥物治療效果評估

1.3.1 肺濕重/干重比（W/D）測定：造模24 h后，每組5只小鼠頸椎脫臼法處死，取全肺組織，用 4 ℃預冷的PBS洗去肺組織表面的殘血（沖洗2次），在濾紙上吸干水分，稱重，記為肺組織濕重（wet weight，W），然后將其置于80 ℃烘箱中烘烤約48 h 至恒重后稱定干重（dry weight，D），計算肺W/D。 W/D代表肺含水量，可評定肺組織水腫的嚴重程度。

1.3.2 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）收集及細胞因子檢測：造模24 h 后，每組5只小鼠頸椎脫臼法處死，剪開頸部皮膚，分離頸部肌肉，暴露氣管，在氣管遠端剪一小口，插入導管固定。分3次灌洗，每次注射500 μL PBS，停留30 s后抽出，收集BALF，其回收率約為90%。離心BALF，收集上清用于細胞因子檢測，收集底層細胞沉淀用于流式細胞術對中性粒細胞及巨噬細胞計數。用PBS洗滌以上收集的細胞并進行分組，分別加入相應的流式抗體冰上孵育1 h，所用的流式抗體包括：anti-CD11b-APC、anti-Gr-1-FITC和anti-F4/80-FITC，隨后用PBS離心洗滌細胞3次，并用 300 μL PBS重懸細胞后上機流式檢測。最終CD11b+Gr-1+標記為中性粒細胞，CD11b+F4/80+標記為巨噬細胞。將收集的BALF上清液，參照ELISA試劑盒操作說明書檢測BALF中細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的濃度。

1.3.3 肺組織病理形態學觀察及NF-κB信號通路蛋白檢測：“1.3.2”項的5只小鼠打開胸腔，取出肺組織。右肺用4 ℃預冷的PBS洗去肺組織表面的殘血，然后將其置于多聚甲醛溶液中固定24 h，70%乙醇脫水3次，冰凍切片、HE染色觀察。左肺提取肺組織蛋白，采用BCA法進行定量，SDS-PAGE電泳后電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入目標一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入相應HRP標記的二抗室溫孵育2 h，滴加ECL發光，顯影，使用Image J進行灰度分析。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS20.0軟件進行統計學分析。計量資料采用±s表示，各組間指標差異比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 WOG對LPS誘導的小鼠肺W/D的影響 LPS氣管灌注造模24 h后，對其W/D進行測定評估肺水腫的程度。與Control組比，LPS組W/D值顯著升高，WOG組W/D值顯著低于LPS組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05），見圖1。

2.2 WOG對LPS誘導的ALI小鼠肺組織病理學變化的影響 LPS刺激24 h后，與Control組相比，LPS組小鼠肺部有大量炎性細胞浸潤（中性粒細胞和巨噬細胞），肺組織間隙可見大量紅細胞滲出及肺泡壁增厚。與LPS組相比，WOG組小鼠上述病理變化均有明顯改善，見圖2。

圖1 3組肺組織W/D比較

2.3 WOG對ALI小鼠BALF中中性粒細胞、巨噬細胞水平的影響 LPS氣管灌注造模24 h后，流式細胞儀檢測小鼠BALF中炎性細胞（巨噬細胞、中性粒細胞）數量。LPS組中巨噬細胞和中性粒細胞的濃度與Control組比顯著增高（P＜0.01）；與LPS組比，WOG組巨噬細胞、中性粒細胞的水平均顯著降低（P＜ 0.01）。見圖3。

2.4 WOG對ALI小鼠BALF中細胞因子的影響 LPS氣管灌注造模24 h后，測定BALF中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的水平。與Control組比，LPS組BALF中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α表 達水平明顯升高，WOG組BALF中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α表達水平較LPS組明顯降低（P＜0.01），見圖4。

2.5 WOG對LPS誘導的ALI小鼠NF-κB信號通路的影響 與Control組比，LPS刺激24 h后，LPS組小鼠肺組織IκB（inhibitor of NF-κB）顯著降解，導致磷酸化IκB（p-IκB）大量生成，WOG可明顯地抑制IκB的降解，阻斷NF-κB信號轉導通路激活（P＜0.05），見圖5。

3 討論

ALI是由全身炎癥反應所導致的綜合征，臨床表現彌漫性肺泡及肺血管內皮細胞損傷、肺組織水腫及肺不張等病理特征，嚴重時可發展為ARDS。ALI病理改變主要體現在肺泡-毛細管屏障滲透性增加，炎癥細胞的細胞因子、趨化因子和黏附分子等炎癥介質過量產生[5-7]。由于ALI發病機制不明確且預后不良，因此是呼吸危重癥醫學界研究的難點和熱點。本研究通過構建LPS誘導的小鼠ALI模型，探究傳統中藥黃芪的主要藥理成分WOG治療ALI的潛在作用及機制，為WOG的臨床運用提供理論基礎。

圖2 小鼠肺組織病理切片（HE，×200）

圖3 流式細胞術檢測小鼠BALF中巨噬細胞和中性粒細胞水平

與Control組比：aP＜0.05；與LPS組比：bP＜0.05。每組5只

圖5 3組ALI小鼠NF-κB信號通路檢測

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，使用LPS進行小鼠滴鼻后可在肺組織募集包括中性粒細胞及巨噬細胞在內的多種炎癥細胞，而此類炎癥細胞也可釋放TNF-10、IL-6等炎癥細胞因子，通過旁分泌的方式誘導中性粒細胞激活引起突發性呼吸、過氧化物酶釋放，最終加重肺部損傷[8]。因此，抑制免疫細胞過度活化和細胞因子的分泌是延緩ALI病程的關鍵。有研究表明，甘草黃酮、姜黃素等中藥能夠通過抑制炎癥細胞、抑制細胞因子分泌來治療ALI[9-10]，同時WOG已經在皮膚炎癥、腦損傷等多種炎癥參與的動物疾病模型中被證明有治療效 果[3，11]。本研究則發現WOG對ALI亦有治療效果，動物實驗結果表明預先腹腔注射5 mg/kg的WOG，可減輕肺部炎性細胞浸潤（中性粒細胞和巨噬細胞）及顯著降低肺組織的W/D；流式細胞術及ELISA結果也顯示WOG治療后BALF中炎性細胞含量下降，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等促炎性細胞因子的產生減少。表明WOG可通過抑制機體免疫細胞的過度活化來對ALI起治療效果，且相較于臨床上使用激素治療ALI可能帶來的不良后遺癥，WOG或有更好的應用前景。

參與ALI疾病發展的信號轉導過程相對復雜，至今尚未完全明確，但有文獻初步報道NF-κB信號途徑在其中發揮著重要的作用[12-13]。革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分LPS可通過TLR4活化NF-κB信號通路啟動下游如炎性細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10）、黏附分子、集落刺激因子等炎癥信號的釋放，因此細菌感染也是導致ALI的重要病因[14-16]。 本研究發現，WOG可能通過抑制NF-κB信號通路的活化來緩解ALI的病情。Western blot結果表明：LPS刺激后，p-IκB水平升高，顯示NF-κB信號通路被激活；而在WOG預先處理的小鼠肺組織中p-IκB水平升高不明顯。因此，WOG處理的小鼠，可以通過抑制IκB磷酸化的方式抑制NF-κB信號通路的激活，進而影響下游的炎性細胞因子的釋放，并發揮相應的治療效果。

本研究也存在一定的不足之處，例如未測定小鼠肺通氣量，細胞核及細胞質中NF-κB的p65、p50兩個亞基的變化水平有待進一步分析，以及炎癥相關的趨化因子的變化水平也有待進一步探討。

綜上所述，WOG可通過抑制NF-κB信號通路的活化來減輕炎癥反應，并發揮對LPS致小鼠ALI的保護作用。