一個純合子Tyr503Cys突變導致的遺傳性凝血因子Ⅺ缺陷癥家系分析

周星星，李小龍，金艷慧，楊麗紅，潘景業，蘇看看，王明山

（溫州醫科大學附屬第一醫院 醫學檢驗中心，浙江 溫州 325015）

凝血因子XI（FXI）是絲氨酸蛋白酶原，由肝細胞和巨核細胞合成。其可被凝血酶激活，當凝血被外源性（組織因子）途徑觸發時即可啟動內源性凝血途徑，活化的FXI I（FXI Ia）和活化的FXI（FXIa）也可以通過切割FX I的Arg369-Ile370鍵來激活FX I。遺傳性FX I缺陷癥（OMIM 264900）為常染色體隱性遺傳病，是一種罕見的出血性疾病，通常很少導致自發性出血。但根據FXI水平降低的不同，會具有不同的出血表現型，出血傾向與FXI血漿水平之間的關系尚不清楚[1]。根據FXI活性（FXI:C）和FXI抗原（FX I:Ag）水平的不同，該病可分為兩型，I型為交叉反應物（cross-reacting material，CRM）陰性（FXI:C和FXI:Ag同步減少），I I型為CRM陽性（FXI:C減少，FXI:Ag正常）[2]。本研究對1例純合F11基因突變導致的遺傳性FXI缺陷癥家系進行實驗室表型與基因檢測，并采用生物信息學相關軟件對其基因突變的位點進行分析，初步探討其分子致病機制。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者，女，64歲，由于下肢運動障礙收住溫州醫科大學附屬第一醫院，而后診斷為“下肢靜脈功能不全”，無其他臨床癥狀，個人及家族成員 均沒有出血傾向，肝、腎功能正常。常規凝血試驗顯 示活化部分凝血酶時間（activated partial thrombin time，APTT）延長為59.3 s（29.0～41.0 s）。 進一步檢查發現FIX:C降至13%（82%～118%），FX I:Ag 正常，為76%（75%～125%）。其他測試指標如凝血酶原時間（pro-thrombin time，PT）、FVIII:C、FIX:C和FXII:C均在正常參考范圍，初步診斷為FXI缺陷癥。通常三代以內的聯姻被定義為近親婚姻。通過家系調查發現，先證者父母之間存在血緣關系，其母親的祖母和父親的祖父是兄妹關系，家系遺傳圖譜見圖1。選擇100名年齡22～56歲，無肝、腎功能異常，且無其他基礎性疾病的健康體檢者，其中男53名，女47名。本研究通過本院倫理委員會審查，征求本人同意，對上述人員采集血樣。

圖1 遺傳性FXI缺陷癥先證者家系圖

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理：采集受檢者外周靜脈血 2.7 mL，以0.109 mol/L枸櫞酸鈉1:9抗凝，3 000 r/min 離心10 min，上層乏血小板血漿用于凝血指標檢測，并于2 h內完成，下層血細胞用于提取基因組DNA，并進行PCR擴增及測序。

1.2.2 血漿凝血指標檢測：PT、APTT、FVIII:C、FIX:C、FXI:C和FXII:C等凝血指標采用一期凝固法在法國Stago STA-R全自動血凝儀上測定（配套試劑由法國Stago公司提供）；FX I:Ag采用ELISA法測定。所有操作步驟均嚴格按照試劑說明書進行。

1.2.3 PCR擴增及電泳：采用酚-氯仿法抽提受檢者的外周血基因組DNA，參照文獻[3]設計合成PCR引物（由上海桑尼生物科技有限公司合成）。所有PCR擴增均在25 μL反應體系中進行，包括12.5 μL PCR擴增反應物（2×）（北京天根生化科技有限公司），8 μL ddH2O，1 μL上游引物，1 μL下游引物 （10 mmol/L），2 μL基因組DNA模板（100 ng）。將DNA樣品95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行30個循環，最后在Applied Biosystem熱循環儀2720（美國ABI公司）上以（72±8）℃延伸10 min。將5 mL PCR擴增產物置于含Tris硼酸鹽緩沖液（pH 8.3）的1.5%瓊脂糖凝膠上，用GoldView I I核酸著色劑（上海藍季科技發展有限公司）染色，通過電泳檢測擴增效果。純化后，PCR產物送上海桑尼生物工程有限公司直接測序。

1.2.4 DNA測序分析：將測序結果與GenBank數據庫中F11基因序列（NG_008051.1）比對，發現突變位點后，反向測序予以證實。先擴增先證者F11基因各外顯子、側翼序列以及5’端、3’端非翻譯區，發現突變位點后再擴增其他家系成員相應外顯子片段。同時篩選來自相同區域共計100名（200個等位基因）健康個體來排除基因多態性。

1.2.5 氨基酸突變位點保守性與危害性分析：采用ClustalX-2.1-win軟件將突變氨基酸與其他同源物種的氨基酸序列進行比對，分析突變氨基酸在物種進化過程中的保守性。用3種在線生物信息學軟件來預測突變是否影響蛋白質功能：Phenotyping-2 （http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml）、PROVEAN（http://provean.jcvi.org/seq_submit.php）以及MutationTaster（http:// www.mutationtaster.org）。FXI的蛋白質參考ID：P03951，蛋白質參考轉錄本ID：ENST00000403665。1.2.6 突變蛋白空間結構模型分析：以蛋白質數據庫（PDB，http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do，PDB ID：1xx9）中的三維結構為基礎，通過spdbv 軟件和蛋白質相互作用計算器程序（http://pic.mbu.iisc.ernet.in）生成蛋白質模型。分析F11基因突變前后由氨基酸變化引起的蛋白質空間結構的改變。

2 結果

2.1 凝血指標檢測結果 先證者APTT為59.3 s，明顯延長，FXI:C降低至13%；其母親、女兒和兒子的APTT均有不同程度延長，FXI:C降至37%～42%。該家系5人FXI:Ag、PT均正常，見表1。FVIII:C、FIX:C和FXI I:C也均在參考范圍。

表1 遺傳性FXI缺陷癥家系成員表型及基因型檢測結果

2.2 基因突變檢測結果 DNA測序分析顯示，先證者F11基因第13號外顯子中存在c.1562A＞G純合錯義突變，導致Tyr503Cys突變；其母親、兒子和女兒均存在Tyr503Cys突變雜合子；妹妹是野生型。對100名健康對照者F11基因第13號外顯子進行測序，均未發現c.1562A＞G，排除基因多態性，見表1和圖2。

2.3 氨基酸突變位點保守性與危害性結果 通過同源序列比對，Tyr503在同源物種間高度保守。PolyPhen-2評分結果為1.000分，PROVEAN評分結果為-3.352分，均預示此突變很可能是有害突變；Mutation Taster評分結果為0.998分，預示此突變可引起相關疾病。

圖2 Tyr503Cys突變測序圖

2.4 突變蛋白空間結構模型分析結果 模型分析表明，野生型Tyr503與Ile370、Lys554形成2個氫 鍵；當突變為Cys503后其苯環消失，同時與Lys554之間新增了1個氫鍵，導致蛋白質結構改變，見圖3。

圖3 Tyr503Cys突變模型

3 討論

本家系研究表明，先證者攜帶Tyr503Cys純合錯義突變，其FXI:C降低至13%，但FXI:Ag水平正常。其母親、兒子和女兒攜帶Tyr503Cys雜合子，FXI:C均降低至40%左右，FXI:Ag水平正常。其妹妹為野生型Tyr503，FXI:C和FXI:Ag均正常。通過添加正常血漿混合物可以糾正FXI:C降低，由此可以確定血液中不含有針對FXI的循環抗凝劑。另外，我們沒有發現其他凝血指標異常。因此，可以初步認為該突變是導致FXI:C降低的原因。根據家系圖，發現兒子和女兒攜帶的Tyr503Cys雜合突變等位基因均來自于先證者。先證者的父母存在血緣關系，母親是雜合子，盡管先證者父親已故，但可以高度假設先證者的純合等位基因分別遺傳自其父親和母親。其遺傳規律符合遺傳性FXI缺陷癥常見的常染色體隱性遺傳特征。由此可知該突變導致了遺傳性FXI缺陷癥，同時為交叉反應物質陽性（CRM陽性，I I型）。

保守性分析結果顯示，Tyr503在同源物種間高度保守，表明它是FXI中維持蛋白質正常功能的重要組成部分。Tyr503位于F11基因的催化結構域（催化三聯體：H413-A462-S557），因此Tyr503Cys突變可能會導致FXI功能嚴重缺陷。有報道[4-5]指出，Tyr503殘基發生移碼突變（Tyr503ValfsX32）會造成FXI多肽催化結構域的破壞。3個生物信息學軟件分析結果均表明Tyr503Cys是一種有害的突變，可能影響FXI蛋白質的結構和功能，從而導致疾病的發生。

FXI蛋白由625個氨基酸組成，包含36個半胱氨酸，其中除了p.Cys11，p.Cys321外，其余半胱氨酸之間形成的二硫鍵均與蛋白質結構直接相關，這足以說明半胱氨酸殘基對FXI蛋白的重要性。MITCHELL 等[6]曾報道新產生的半胱氨酸可破壞蛋白質結構，導致其功能受損。在本研究中，催化結構域中原來的Tyr503被Cys替代，這可能會導致二硫鍵錯配，從而影響蛋白質的功能。同時，根據表型推測，突變不會影響蛋白質的合成和分泌。此外，模型分析顯示突變導致氨基酸之間的氫鍵改變，使得Cys503和Lys554之間產生額外1個氫鍵。同時突變為Cys503 后其苯環消失，導致蛋白質結構改變，引起FXI蛋白功能失調。

到目前為止，人類基因數據庫共收錄了225種F11基因突變類型。I I型突變類型較少，其中4例有特殊的致病機制，Ser248Asn是一種多態性，導致血小 板親和力降低[7]；Pro520Leu一定程度上破壞了催化活性[8]；Gly555Glu大幅降低了FIX激活的速度[9]； Val371Ile影響FXI和FIX的激活[10]。而本研究中，Tyr503Cys突變替換產生了半胱氨酸殘基，導致形成額外的氫鍵和二硫鍵，影響FXI蛋白的結構和功能。該突變豐富了數據庫，并有助于未來對F11基因突變的研究，特別是I I型。

綜上所述，本研究報道了1例中國有血緣關系的家系中發現F11基因純合錯義突變（Tyr503Cys），并對其分子發病機制進行了初步探討，顯示該突變可能是導致FXI:C下降的原因。但其確切的分子致病機制有待進一步研究。