GLUT-1、HIF-1α及p-AKT在頭頸部神經內分泌癌組織中的表達意義

杜海松

神經內分泌癌(neuroendocrine carcinoma，NEC)是由神經內分泌細胞分化所致的獨特的惡性腫瘤[1]。NEC可發生在機體各個部位，尤以肺部及消化道最為常見，較少發生于頭頸部[2]。頭頸部NEC形態學和超微結構與發生在頭頸部的其他惡性腫瘤存在顯著不同，2005年WHO將頭頸部NEC分為典型類癌(高分化)、不典型類癌(中分化)、小細胞癌(低分化)及混合型小細胞癌[3]。臨床主要采用手術+放化療及單純放化療的治療方式。近年來，隨著免疫學及分子生物學的不斷發展，人們逐漸認識到基因表達是惡性腫瘤侵襲、轉移的重要機制之一[4]。有相關研究證實葡萄糖轉運蛋白-1(glucose transporters-1，GLUT-1)、低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、p-AKT表達與喉癌中SUV增高緊密相關[5]。但頭頸部NEC與GLUT-1等基因相關性的報道較少?；诖?，本研究以2012年1月至2014年1月本院收治的126例頭頸部NEC患者為研究對象，分析GLUT-1等基因在頭頸部NEC患者的表達情況及與預后的相關性，試圖為頭頸部NEC的靶向治療提供臨床參考依據。

1 材料與方法

1.1 一般性資料

選取2012年1月至2014年1月本院收治的頭頸部NEC患者共126例，為研究組，其中男性75例，女性51例，年齡49～73歲，平均年齡(60.24±12.35)歲，病變部位：鼻腔29例，喉80例，扁桃體13例，氣管4例；TNM分期：T1 17例，T2 75例，T3 19例，T4 15例；病理分型：高分化21例；中分化31例；低分化74例；另選同時期在本院治療的鼻息肉或聲帶息肉患者共126例，為對照組，其中男性68例，女性58例，年齡50～71歲，平均年齡(58.14±13.57)歲，兩組患者性別、年齡相當，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 納入及排除標準

納入標準：頭頸部NEC患者符合頭頸部NEC診斷標準并經光鏡及電鏡確認；鼻息肉及聲帶息肉患者經光鏡及電鏡確認；術前未接受放、化療治療；資料完善；自愿加入本次研究的患者。排除標準：合并有心、肝、腎等疾病的患者；臨床病理資料不完整的患者；病理分期及分型不明確的患者；因特殊原因不能配合完成本次研究的患者；不愿加入本次研究的患者。

1.3 研究方法

采用免疫組織化學二步法對兩組患者GLUT-1、HIF-1α、p-AKT表達情況進行檢測，操作步驟參照試劑盒說明書，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，常規脫蠟水化，PBS液沖洗3次，每次3 min，高溫高壓下，抗原修復液(PH 6.0)修復，TBS液(PH7.2)清洗3次，往切片上滴加一滴H2O2溶液，室溫孵育10 min，滴加血清20 min后，除去多余血清，滴加一抗60 min后，PBS清洗后，往切片上滴加一滴Elivision plus增強液，孵育20 min，PBS清洗后，往切片上滴加一滴酶標抗鼠/兔聚合物，孵育20 min，PBS清洗后，往切片上滴加2滴DAB顯色液，顯微鏡下觀察，自來水沖洗，DAB顯示，蘇木精復染，樹膠封片。

1.4 結果判斷

以切片內紅細胞染色作為GLUT-1陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。在光鏡下，GLUT-1細胞呈基本均勻的棕黃色，HIF-1α、p-AKT陽性細胞位于細胞質和細胞膜，呈均勻的棕黃色顆粒。每個切片隨機觀察10個視野，每個視野計100個腫瘤細胞，計算陽性表達率，陽性表達率小于25%為陰性(-)，陽性表達率大于25%為陽性(+)。術后對頭頸部NEC患者進行隨訪，記錄術后3年內預后情況(復發、遠處轉移、生存率)。

1.5 統計學分析

應用SPSS 20.0軟件處理，GLUT-1、HIF-1α、p-AKT與臨床病理因素的關系用χ2和Spearman相關性檢驗，單因素分析采用log-rank檢驗，多因素分析采用Cox比例風險回歸分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者GLUT-1、HIF-1α、p-AKT表達情況對比

結果顯示，研究組GLUT-1、HIF-1α、p-AKT陽性表達率顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者GLUT-1、HIF-1α、p-AKT表達情況對比(例，%)

2.2 研究組患者GLUT-1、HIF-1α、p-AKT表達與臨床病理特征關系分析

結果顯示，頭頸部NEC患者GLUT-1與病變部位、淋巴結轉移及遠處轉移顯著相關(P<0.05)；HIF-1α、p-AKT與遠處轉移顯著相關(P<0.05)，見表2。

表2 研究組患者GLUT-1、HIF-1α、p-AKT表達與臨床病理特征關系分析/例

2.3 研究組患者GLUT-1、HIF-1α、p-AKT表達與預后關系分析

對3年隨訪情況進行統計，結果顯示，126例頭頸部NEC患者中44例(34.9%)死亡，5例失訪，50例(39.7%)復發，29例(23.0%)發生遠處轉移。頭頸部NEC患者GLUT-1、HIF-1α、p-AKT陽性表達的患者3年生存率顯著低于GLUT-1、HIF-1α、p-AKT陰性表達的患者，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 研究組患者GLUT-1、HIF-1α、p-AKT表達與預后關系分析

2.4 研究組患者GLUT-1、HIF-1α及p-AKT表達的相關性

通過對頭頸部NEC患者GLUT-1、HIF-1α及p-AKT表達進行分析，結果顯示，GLUT-1與HIF-1α表達存在顯著相關(P<0.05)；p-AKT與HIF-1α表達存在顯著相關(P<0.05)，見表4。

表4 研究組GLUT-1、HIF-1α及p-AKT表達的相關性/例

3 討論

NEC屬上皮源性神經內分泌腫瘤，胃類癌、肺小細胞癌是其常見類型，頭頸部NEC較為少見[6]。目前，對于頭頸部NEC尚無較為十分有效的治療方法，因此，探尋頭頸部NEC治療的新方式逐漸成為臨床研究的熱點。由于腫瘤細胞增殖、分化、轉移等過程需要消耗大量的能量，因此，葡萄糖攝取增加是腫瘤細胞的重要標志[7]。GLUT-1是細胞攝取葡萄糖的重要載體，能介導葡萄糖分子跨膜轉運。在很多惡性腫瘤組織中都發現了GLUT-1表達升高[8]。HIF-1α是機體細胞在缺氧狀態下的重要轉錄因子，常在缺氧微環境中高表達，一方面可促進乏氧反應性基因表達，另一方面可上調腫瘤細胞增殖，進而導致缺氧加劇，造成缺氧微環境的形成，目前在結腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤組織中都發現了HIF-1α的高表達[9]。AKT是重要的信號蛋白分子，參與PI3K信號傳導的關鍵環節，p-AKT是AKT的功能活化狀態。有研究顯示，在鼻咽癌、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤組織中均存在p-AKT高表達[10]。

頭頸部NEC與其他惡性腫瘤一樣，具有無限增殖、生長、侵襲的特性，因此，其發生發展過程中需要消耗大量能量，其中葡萄糖是能量的主要來源[11]。GLUT-1作為介導葡萄糖攝取的重要載體，因此，我們推論GLUT-1在頭頸部NEC組織中必然會過度表達。本研究結果顯示，頭頸部NEC患者GLUT-1陽性表達顯著高于鼻息肉或聲帶息肉患者，證實了以上推論，說明GLUT-1與惡性腫瘤的發生發展密切相關，可作為頭頸部NEC的標志物之一。惡性腫瘤增殖過程中，普遍存在缺氧現象，HIF-1α作為缺氧狀態下的重要轉錄因子，有研究顯示，頭頸部鱗癌腫瘤組織HIF-1α陽性表達率高達45%以上[12]。本研究結果顯示頭頸部NEC患者HIF-1α陽性表達率為56.35%，顯著高于非惡性腫瘤的陽性表達率(3.17%)，與相關研究結果類似，說明HIF-1α參與了NEC腫瘤的生長和生存。PI3K-AKT信號通路是癌細胞存活的關鍵通路，調控著腫瘤細胞的轉錄、增殖、代謝、凋亡、轉移、侵襲等過程。PI3K可使AKT硝酸化，從而產生p-AKT，p-AKT可導致下游的色氨酸殘基硝酸化，從而激活相關因子，發揮其調控功能[13]。因此，很多惡性腫瘤組織中發現了p-AKT高表達。本研究顯示，頭頸部NEC患者p-AKT高表達，與相關研究結果一致，提示PI3K-AKT信號通路在頭頸部NEC的發展存在一定關聯。本研究對其GLUT-1、HIF-1α及p-AKT表達與頭頸部NEC臨床病理特征及預后進行分析，結果顯示GLUT-1與病變部位、淋巴結轉移及遠處轉移相關，HIF-1α、p-AKT與遠處轉移相關，提示GLUT-1、HIF-1α及p-AKT表達與臨床病理特征密切相關，具體機理尚不明確，需進一步研究。本研究顯示GLUT-1、HIF-1α及p-AKT高表達的頭頸部NEC患者預后情況更差，與國外相關研究結果一致[14]，表明其可能參與了該惡性腫瘤的轉移、復發及侵襲，提示對GLUT-1、HIF-1α及p-AKT表達進行聯合檢測，對于判斷腫瘤惡化程度及預后預測具有重要意義。本研究結果顯示，HIF-1α表達與GLUT-1及p-AKT存在一定相關性，HIF-1α與GLUT-1表達相關的機制可能為：在缺氧情況下，HIF-1α大量表達，GLUT-1作為HIF-1α的靶向基因，GLUT-15段的增強子序列被激活，從而引起GLUT-1也出現大量表達，進而增強葡萄糖的轉運數量及糖降解；非缺氧情況下，表皮生長因子及部分癌基因在刺激HIF-1α表達的同時，也會刺激GLUT-1的表達。HIF-1α與p-AKT表達相關的機制可能為缺氧情況下，PI3K-AKT信號通路激活，促進HIF-1α的表達；非缺氧情況下，通過激活AKT使HIF-1α表達升高，同時，AKT負調節因子也可降低HIF-1α的表達，從而使其表達與p-AKT表達步調一致[15]。

綜上所述，GLUT-1、HIF-1α、p-AKT表達存在一定相關性，臨床檢測GLUT-1、HIF-1α、p-AKT表達，對于頭頸部NEC患者的療效判斷和預后預測有一定的臨床價值。