非小細胞肺癌組織中VEGF和Endostatin的表達意義

史玉卿

肺癌是臨床常見惡性腫瘤，其發病率上升與我國大氣污染、致癌物增多、煙民增多、人口老齡化等有關，目前是我國人民死亡的主要疾病之一。非小細胞肺癌是組織學分類下的肺癌類型，占所有肺癌的80%，是臨床常見類型[1]。非小細胞肺癌惡性程度高，早期廣泛遠處轉移率較高，新確診的患者中超過70%已近達到中晚期，導致患者失去手術機會，死亡率高，即使得到一定有效治療后5年生存率仍然極低；目前在我國惡性腫瘤致死率中占首位[2]。目前主要治療方法包括手術和放化療，臨床常常采用綜合多種方法進行治療。研究發現腫瘤血管在腫瘤產生、增殖、轉移等方面具有促進作用，因此抑制腫瘤血管是抗腫瘤重要途徑。本研究分析了Endostatin、VEGF與非小細胞肺癌微血管密度、分期、腫瘤直徑等的關系，現在將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

于2015年3月至2017年8月廊坊市人民醫院符合研究標準的189例非小細胞肺癌患者納入研究。納入標準[3]：穿刺活檢、組織學病理或(和)細胞學確認的非小細胞肺癌患者。排除標準：參與本研究前有抗腫瘤治療史；有肝、腦、腎、心等重要臟器嚴重原發病變[4]。本研究經醫院倫理委員會審批同意。共納入189例。患者資料：男性110例，女性79例；病理類型：腺鱗癌14例，腺癌85例，鱗癌90例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期150例。

1.2 方法

VEGF檢測方法：免疫組化染色單抗VEGF、SP免疫試劑盒。免疫組化染色非小細胞肺癌患者手術中取得標本蠟塊的癌旁正常組織和腫瘤組織。根據試劑盒嚴格操作，DAB顯色用蘇木精復染。使用EDTA水煮法進行抗原修復。炎性對照采用已知為陽性的標本，陰性對照組用PBS代替一抗。細胞胞質未染色為陰性，若呈棕褐色或棕黃色則為陽性。陽性細胞表達結果根據Senger法進行判斷，陽性細胞評分：陽性細胞>50%為3分，陽性細胞占26%～50%為2分，陽性細胞占25%為1分，無陽性細胞則為0分；染色強度：強陽性為3分，中等強度陽性記為2分，弱陽性為1分，陰性為0分。總積分=染色強度分值×陽性細胞分值，總分為3～6分可判斷為陽性，0～2分則為陰性。

Endostatin檢測：使用兔抗人Endostatin多克隆體一抗，過氧化酶一鏈親和素復合物，生物素化羊抗兔抗體。LSAB法，將術中獲取標本石蠟切片常規脫蠟，使用過氧化氫(3%)阻斷內源性過氧化物酶，將羊血清肺部非特異性抗原(3%)加入后加入一抗(1∶50)、二抗(1∶200)、SP復合物；滴入一抗后在37°溫箱中孵育1h，PBS沖洗，再孵育30 min，再沖洗，行DAB顯色，蘇木精復染，封片。用健康人體扁桃體組織切片做陽性對照。陽性判斷[5]：若其在漿細胞、支氣管管壁腺體細胞、血管內皮細胞、淋巴細胞上均有黃色顆粒則為陽性；用400倍光鏡5～10野的切片，每視野記100～200個支氣管黏膜上皮細胞或腫瘤細胞，共記錄1 000個，計算陽性細胞百分比，結果為切片Endostatin陽性水平。

1.3 觀察指標

統計VEGF陽性率和Endostatin陽性率，對比不同年齡、性別、發病部位、腫瘤直徑、病理類型、TNM分期、淋巴結轉移情況、微血管密度時VEGF陽性率和Endostatin陽性率。將有意義因素進行多因素分析，找出與VEGF表達和Endostatin表達有關的因素。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 單因素分析

Endostatin及VEGF陽性表達與各臨床病理參數的關系，見表1。

2.2 COX回歸模型分析

Endostatin陽性與腫瘤大小、淋巴結轉移、MVD呈負相關；VEGF陽性與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期、MVD呈正相關，P均<0.05，差異有統計學意義，見表2。

3 討論

VEGF與腫瘤血管生成的關系及VEGF與腫瘤生長的關系：本研究證實VEGF與非小細胞肺癌MVD呈正相關，P<0.05，即VEGF水平越高則MVD值越高，腫瘤進展風險越大。①VEGF是腫瘤血管生成刺激因子，當腫瘤內部缺氧時VEGF上調，VEGF與新生血管空間及時間均密度有關[6]。在動物實驗中發現VEGF引導一系列血管反應，VEGF能提高血管通透性，是目前發現的最強血管通透性刺激物[7-8]。②在活體實驗中，VEGF被證實對腫瘤血管有增殖作用，是血管新生必須因子，而新生血管又促使腫瘤生長；腫瘤生長到一定體積后，腫瘤中央部分細胞離血管較遠而缺氧，低氧狀態刺激某些分子感受器，激活VEGF等血管新生因子[9-10]。③VEGF經腫瘤細胞釋放后與血管內皮細胞受體結合，促生心血管，是腫瘤生長的營養供給渠道[11-12]。故本研究中腫瘤直徑較大的患者VEGF陽性率更高，P<0.05。目前臨床已經將VEGF作為抗腫瘤血管新生的觀察指標，以抑制VEGF的抗腫瘤藥物正在大量實驗。本研究還發現Endostatin與腫瘤血管生成的關系：本研究經多因素分析發現VEGF與非小細胞肺癌MVD有關，P<0.05。有研究者[13]發現內皮抑素成陽性的非小細胞肺癌組織中，MVD為(25.49±9.42)；在內皮抑素陰性表達的非小細胞肺癌組織中，MVD為(35.18±8.87)，差異顯著，P<0.05；經多因素分析發現內皮抑素與非小細胞肺癌MVD呈負相關(R=0.641，P=0.000)。與本研究結果一致。Endostain對血管形成基因(EGFR、VEGF-A等)有下調作用，能上調抗血管形成基因(EphrinB3、HIF-AN等)表達，實現病理性血管雙向調節；能使血管形成信號專遞途徑下調，具有廣泛抗血管形成作用[14-15]。即Endostatin水平越高，MVD值越低，腫瘤進展風險越低，腫瘤直徑越小。故本研究中腫瘤較小者Endostatin陽性率更高，P<0.05。本研究還發現Endostatin與非小細胞肺癌淋巴結轉移有關，P均<0.05。

表1 非小細胞肺癌中Endostatin及VEGF表達情況(例，%)

表2 COX多因素分析

綜上，Endostain有抑制腫瘤血管新生作用，VEGF有促腫瘤血管生成作用，前者對非小細胞肺癌有抑制作用，非小細胞肺癌組織中Endostain越高則TNM分期越低，腫瘤越小，淋巴轉移風險越低；后者對非小細胞肺癌有促進作用，癌組織中VEGF越高則癌灶進展、轉移風險越高。Endostain、VEGF為抗非小細胞癌提供了新思路，通過觀察術中獲取癌旁組織和癌組織中Endostain、VEGF水平能更準確評估預后。