丹皮酚肟香豆素的設(shè)計(jì)與合成

王 蓉，張 灼，何黎琴*

1.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，亳州,236800；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥,230031

心腦血管疾病具有極高的致殘率及致死率，占疾病病亡的40%以上[1]。研究表明，心腦血管疾病發(fā)生源于許多復(fù)雜的病理因素，血小板的異常聚集是動脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素之一。臨床上采用中藥活血化瘀法治療心腦血管疾病等取得了令人矚目的進(jìn)展。從中藥中研發(fā)新藥或先導(dǎo)化合物是當(dāng)前國內(nèi)外創(chuàng)制新藥的重要研究途徑之一。丹皮酚(Paeonol,Pae) 作為中藥牡丹皮的主要活性成分，具有廣泛的藥理活性，包括抗菌[2]、抗血小板聚集[3]、抗炎[4]、抗過敏[5]、消炎[6]、抗病毒[7]、抗癌[8]和解熱鎮(zhèn)痛[9]等作用。研究表明，丹皮酚在緩解動脈粥樣硬化(AS)進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用[10，11]，因此有望成為良好的治療心腦血管疾病藥物。但由于丹皮酚具有水溶性差、易升華及在體內(nèi)代謝速率較快等缺點(diǎn)[12]，使其臨床應(yīng)用范圍受到一定的限制，故通過化學(xué)手段對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾與改造，以改善上述缺點(diǎn)，顯得尤為必要。

以中藥活性成分為先導(dǎo)化合物，結(jié)合結(jié)構(gòu)與生物活性關(guān)系和體內(nèi)代謝研究進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和類似物合成，以提高藥效，降低毒副作用，改善藥物物理及化學(xué)性質(zhì)和藥代動力學(xué)特性已成為新藥創(chuàng)制的重要途徑。基于此，本研究以丹皮酚為先導(dǎo)化合物，對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以期獲得具有臨床應(yīng)用價(jià)值的心腦血管疾病治療藥物。丹皮酚在體內(nèi)代謝速率較快可能與其酚羥基有關(guān)，為此，本文擬對其酚羥基進(jìn)行醚化，提高其代謝穩(wěn)定性，克服丹皮酚易升華的缺點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，肟或肟醚類衍生物具備廣泛的生物活性，部分肟醚類衍生物具有抗血小板聚集作用，如臨床藥物利多格雷等[13]。 為此，對丹皮酚酮羰基進(jìn)行修飾，得到相應(yīng)的肟類衍生物。

香豆素類化合物及其衍生物具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗凝血、抗菌、抗氧化等，其中抗凝血活性是其一大亮點(diǎn)，其主要作用機(jī)制包括對抑制脂質(zhì)過氧化、清除自由基、調(diào)節(jié)心血管功能、松弛血管等[14]。對香豆素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，可以增強(qiáng)其抗血小板聚集活性。課題組前期曾將香豆素-3-羧酸與具有抗血小板聚集的煙酸偶聯(lián)，得到了一系列衍生物，體外抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)表明，所有目標(biāo)化合物的活性均強(qiáng)于陽性對照藥物阿司匹林。所合成的化合物均具有一定的抗血小板聚集活性，且多個(gè)化合物的活性強(qiáng)于陽性對照藥物阿司匹林。

基于此，利用拼合原理，以丹皮酚為先導(dǎo)化合物，對其酚羥基進(jìn)行醚化，然后將其酮羰基肟化，再分別與煙酸和香豆素-3-甲酸拼合成酯，以期得到代謝穩(wěn)定、抗血小板聚集活性更強(qiáng)的候選化合物。

目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)式如圖1。

圖1 3-((((1-(2-乙氧基-4-甲氧基苯基)亞乙基)氨基)氧基)羰基)-2H-苯并吡喃-2-酮

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：BrukerAV-300和500型核磁共振儀，Agilent 1100型ESI/MS質(zhì)譜儀，Nicolet Avatar370DTGS 型紅外光譜儀，ZF-8型暗箱三用紫外線分析儀，ML105型電子分析天平， R1001-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，DF-102B型恒溫磁力攪拌器，WRS-2B數(shù)字熔點(diǎn)儀。

試劑：N,N-二甲基甲酰胺,二乙胺,丹皮酚,溴乙烷,無水乙醇,鹽酸羥胺,二氯甲烷,氯化亞砜。均為市售的化學(xué)純和分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

1.2.1 乙基丹皮酚醚制備中反應(yīng)溶劑的選擇

在乙基丹皮酚醚制備時(shí)，曾以乙腈為溶劑進(jìn)行反應(yīng)，TLC(薄層色譜板)檢測顯示，其反應(yīng)速率很慢且不徹底，產(chǎn)率較低，僅為54%。后改用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)作為溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)能順利進(jìn)行，乙基丹皮酚醚收率提高到98%。其原因可能是NaOH在乙腈中溶解性不好，難以達(dá)到反應(yīng)所需的堿度要求。故最終選擇DMF為反應(yīng)溶劑。

1.2.2 乙基丹皮酚肟合成條件的選擇

(1)反應(yīng)物配比的選擇。設(shè)計(jì)不同投料比，并在各組實(shí)驗(yàn)中用TLC檢測以跟蹤反應(yīng)進(jìn)程，并計(jì)算收率。反應(yīng)結(jié)果如表1所示。

表1 反應(yīng)配比對收率和時(shí)間的影響

注：反應(yīng)溫度為50 ℃。

由表1可見，當(dāng)乙氧基丹皮酚和鹽酸羥胺配比為1∶1時(shí)，反應(yīng)進(jìn)程緩慢，乙基丹皮酚肟收率也很低，只有64.1%。隨著鹽酸羥胺量的增加，不僅反應(yīng)進(jìn)程加快，產(chǎn)物收率也隨之提高。當(dāng)乙氧基丹皮酚和鹽酸羥胺配比為1∶3時(shí)，乙基丹皮酚肟收率有較大提高，進(jìn)一步提高乙氧基丹皮酚和鹽酸羥胺配比，收率提高不明顯，為節(jié)約成本考慮，選取1∶3為最適乙氧基丹皮酚和鹽酸羥胺配比。

(2)溫度對反應(yīng)的影響。以乙氧基丹皮酚肟和鹽酸羥胺反應(yīng)為例，選擇不同溫度段進(jìn)行反應(yīng)，并在各組實(shí)驗(yàn)中用TLC檢測各自反應(yīng)時(shí)間。反應(yīng)時(shí)間及收率結(jié)果見表2。

表2 反應(yīng)溫度對收率和時(shí)間的影響

注：乙氧基丹皮酚∶鹽酸羥胺=1∶3。

由表2可知，隨著反應(yīng)溫度的逐漸上升，反應(yīng)時(shí)間縮短。當(dāng)反應(yīng)溫度到達(dá)60 ℃時(shí)，乙基丹皮酚肟收率下降明顯。這可能是由于隨著反應(yīng)溫度的提高，副反應(yīng)增多，使產(chǎn)物收率有所下降。為此，選擇50 ℃為最適反應(yīng)溫度。

1.3 合成部分

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

以丹皮酚為起始原料，在堿性條件下與溴乙烷反應(yīng)，得到乙基丹皮酚醚(1)；繼而與鹽酸羥胺反應(yīng)得到相應(yīng)的肟(2)；香豆素-3-甲酸與氯化亞砜反應(yīng)得到中間體香豆素-3-甲酰氯(3)；利用2肟羥基與中間體3反應(yīng)得到目標(biāo)化合物4。合成路線見圖2。

圖2 目標(biāo)化合物的合成路線圖

反應(yīng)條件和試劑：a.丹皮酚，溴乙烷，NaOH，二甲基甲酰胺(DMF)，45 ℃，2 h；b.鹽酸羥胺，無水乙醇，50 ℃，吡啶；c.氯化亞砜，二氯甲烷(DCM)，DMF，70 ℃；d.DCM，冰浴，5 h；e.氯化亞砜，DCM，DMF，70 ℃。

1.3.2 乙基丹皮酚醚的合成

稱取丹皮酚2.0 g(12 mmol)，氫氧化鈉3.0 g(75 mmol)于100 mL圓底燒瓶中，加入DMF溶解，在攪拌下滴加溴乙烷(1.8 mL,24 mmol)，于45 ℃下反應(yīng)，薄層色譜(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液傾入100 mL二氯甲烷中，飽和食鹽水洗滌(3×50 mL)，有機(jī)相合并后濃縮，柱層析分離[流動相為乙酸乙酯：石油醚(V∶V)=1∶4],減壓濃縮得白色固體2.3 g，收率達(dá)98.2 %。熔點(diǎn)m.p.69.5 ℃～70.2 ℃。

1.3.3 乙基丹皮酚肟的合成

稱取2.0 g(10.3 mmol)乙基丹皮酚醚于50 mL圓底燒瓶中，加入30 mL無水乙醇使之溶解，依次加入鹽酸羥胺(2.1 g，30.2 mmol)和吡啶(4 mL，49.4 mmol)，50 ℃攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。4 h后反應(yīng)結(jié)束，靜置，反應(yīng)液冷卻至室溫后，攪拌下加入1 L水，析出大量白色固體，抽濾，烘干得白色固體2.0 g，收率93.1%。m.p.131.9 ℃～132.3 ℃。

1.3.4 中間體香豆素-3-甲酰氯的合成

在100 mL圓底燒瓶中加入香豆素-3-甲酸 (3.61 g,19 mmol )、15 mL氯化亞砜、4滴吡啶，70 ℃回流攪拌6 h。減壓濃縮除去過量的氯化亞砜，得黃色固體粗品1.8 g，粗品未經(jīng)純化直接投入下一步反應(yīng)。

1.3.5 目標(biāo)物的合成

3-((((1-(2-乙氧基-4-甲氧基苯基)亞乙基)氨基)氧基)羰基)-2H-苯并吡喃-2-酮的合成[15]如下：

稱取1.8 g(8.6 mmol)乙基丹皮酚肟于50 mL圓底燒瓶中，傾入20 mLDCM使之溶解。冰浴下攪拌，緩慢滴加香豆素-3-甲酰氯2.69 g(12.90 mmol)的DCM溶液，滴加結(jié)束后持續(xù)反應(yīng)0.5 h,撤去冰浴，TLC檢測反應(yīng)進(jìn)程。4.5 h后反應(yīng)完畢，向反應(yīng)液中傾入100 mL冰水淬滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取(3×50 mL)，有機(jī)相合并后再用飽和食鹽水洗滌一次，無水Na2SO4干燥，濃縮，柱層析[流動相為乙酸乙酯∶石油醚(V∶V)=1∶3)，得白色固體2.37 g，收率達(dá)72.3%，m.p.130～130.9 ℃。

1.4 目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)確認(rèn)

1.4.1 紅外光譜

IR(KBr,cm-1)υ:1 753(C=O)；1 616(C=N)；1 569,1 506(C=C)；1 209(C-O)；1 039(N-O);見圖3。官能團(tuán)與目標(biāo)化合物一致。

圖3 3-((((1-(2-乙氧基-4-甲氧基苯基)亞乙基)氨基)氧基)羰基)-2H-苯并吡喃-2-酮的IR光譜

1.4.2 核磁共振氫譜

1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 8.71(s,1H),7.67(t,J = 8.4 Hz,2H),7.45～7.33(m,3H),6.47(d,J = 12.6 Hz,2H),4.05(q,J = 6.9 Hz,2H),3.82(s,3H),2.53(s,3H),1.42(t,J = 6.9 Hz,3H)。結(jié)果見圖4。與目標(biāo)化合物中氫的位移及峰的組數(shù)等相符合。

圖4 3-((((1-(2-乙氧基-4-甲氧基苯基)亞乙基)氨基)氧基)羰基)-2H-苯并吡喃-2-酮的1H-NMR譜

1.4.3 質(zhì) 譜

ESI-HRMS(m/z):785.2299[2M+Na]+見圖5。確定分子量為381,與目標(biāo)化合物一致。

圖5 3-((((1-(2-乙氧基-4-甲氧基苯基)亞乙基)氨基)氧基)羰基)-2H-苯并吡喃-2-酮的MS譜

2 結(jié) 論

以丹皮酚為初始原料，通過酚羥基與溴乙烷成醚；通過酮羰基與鹽酸羥胺成肟，利用肟羥基與香豆素-3-羧酸成酯，并對其合成工藝進(jìn)行了優(yōu)化。在合成乙基丹皮酚醚過程中，選擇N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑。在乙氧基丹皮酚肟的合成過程成中，選擇在50 ℃下反應(yīng)，采用的配比為1∶3，反應(yīng)較快、產(chǎn)率較高，易得目標(biāo)物純品。此外，目標(biāo)物經(jīng)IR、MS和1H-NMR等方法進(jìn)行確證，下一步將對目標(biāo)化合物進(jìn)行細(xì)胞活性篩選。