改性粘土與抑藻菌耦合法抑制錐狀斯氏藻研究*

王 艷，吳 凡，張 沁

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改性粘土與抑藻菌耦合法抑制錐狀斯氏藻研究*

王 艷1*，吳 凡1，張 沁2

（1.深圳職業技術學院，廣東 深圳 518055；2.江西財經大學，江西 南昌 330013）

為了開發高效和環境友好型的抑藻方法，作者研究了2種改性粘土（十六烷基三甲基溴化銨和三丁基十六烷基溴化磷）與抑藻菌聯合使用消殺錐狀斯氏藻（）的效果．結果表明，單獨使用改性粘土時，十六烷基三甲基溴化銨的效果優于三丁基十六烷基溴化磷，但只能在初期（48h內）起到較強的抑制作用，對藻細胞沒有徹底去除．將改性粘土與抑藻細菌（蠟樣芽孢桿菌G4，紡錘形賴氨酸芽孢桿菌J8）進行耦合后，抑藻效果明顯而持續，有效抑藻時間可持續168 h，且未見葉綠素含量明顯的反彈．因此，十六烷基三甲基溴化銨改性粘土與抑藻菌聯合使用有更好的成效，可作為一種極具潛力的環境友好型方法用于有害藻類的治理．

改性粘土；溶藻菌株；錐狀斯氏藻；有害藻華

赤潮作為一種全球性的海洋自然災害已引起世界各國的高度關注．在我國沿海地區，赤潮帶來了嚴重的生態、資源和環境問題，并造成巨大的經濟損失，是濱海生態安全和經濟可持續發展的重大障礙[1-2]，因此，研究新型高效環保的赤潮防控方法，一直是赤潮研究領域亟待解決的問題之一．

現行控制赤潮的方法主要包括物理法、化學法和生物學方法[3-5]，這些方法的單一使用在實際應用中已暴露出一些不足．具體表現在：物理法治理赤潮只能在初期達到有較強的抑制作用，對藻類沒有徹底去除，藻類的爆發存在反彈的可能．而利用化學方法如銅制劑、除草劑等化學殺藻劑雖然可以直接殺死藻類，但這些化學物質的專一性差，容易在食物鏈中富集造成二次污染．一些生物學方法的使用，如攝藻生物的介入，又會造成種群的擾動，帶來潛在的生態風險；且生物學方法見效較慢，不易形成立竿見影的效果．因此如何將已有的技術進行有效耦合，充分發揮各種技術的自身優勢，開發一種集成、高效、環境友好型的抑藻方法一直是科研工作者的努力目標．

近年來，溶藻細菌（algicidal bacteria）的發現給赤潮的治理帶來了新的曙光．它作為水生生態系統生物種群結構和功能的重要組成部分，對維持藻類生物量平衡具有非常重要的作用[6-7]．研究表明，赤潮的消亡可能與溶藻細菌的存在有關[8]．溶藻細菌作為一種有效的生防生物，已越來越多的被關注．國內學者俞至明等應用微生物學方法從赤潮發生區篩選了藻類共生菌，通過分離和純化得到了多株具有溶藻能力的菌株，對東海原甲藻（）、亞歷山大藻（sp.）以及中肋骨條藻（）有較好的抑制作用[9]．然而，隨著研究的深入，人們意識到溶藻菌株的使用效果較為緩慢，一般要在24 h后才能得以體現，尋求一種加速溶藻效果的方法成為了人們關注的目標．

絮凝劑（如改性粘土）是一種天然的高分子電解質，具有較大的比表面積和超強的吸附能力，可吸附水體中過剩的營養物質，是改善水質和加速藻類沉降的可行方法[10]．過去5年里，一些粘土物質，如泥漿水、蒙脫土、蛭石等都顯示出了較好的去藻能力，且最大的優勢在于除藻效果快速而明顯[11-12]．如果能將粘土與溶藻菌聯合使用，利用其各自的優點，則有望開發出更優化的抑藻方法．結合深圳的實際，近年來我市周邊頻繁爆發錐狀斯氏藻赤潮，探索有效的防控手段是維護我市海洋生態安全的有力保障．

為此，作者研究將物理法與生物法耦合的抑藻技術．首先利用改性粘土較大的比表面積以及超強的吸附能力，吸附水體中過剩的營養物質[13-14]，進而通過貧化海水來降低赤潮生物賴以生存、繁殖的物質基礎，隨后輔以適量的溶藻細菌進行消殺，以有效發揮物理法和生物法的優勢，實現快速而持久的抑藻效果．

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：浮游植物分類熒光儀（PHYTO-PAM，WALZ，德國），恒溫搖床（上海一恒），藻細胞培養箱（同田生化），細菌培養箱（蘇州凈化），高溫高壓滅菌鍋（上海儀化），pH計（寧波新天），顯微鏡（Zeiss，LSM 510，德國），以及超凈工作臺等（蘇州凈化）．

主要試劑：NaNO3，NaH2PO4，FeCl3，EDTA，Biotin VH，VB12，HCl，NaCl，CuSO4·5H2O，ZnSO4·7H2O，CaCl2·6H2O，MgCl2·4H2O，Na2MoO4·2H2O，鹽酸硫銨素，十六烷基三甲基溴化銨，三丁基十六烷基溴化磷，胰蛋白胨，酵母提取物，瓊脂粉等．上述試劑除特殊說明外，均為分析純（純度≥99.0%）．試劑主要從Sigma（上海）、國藥（上海）和麥克林（天津）等公司購得．

1.2 試驗藻種、培養方法和葉綠素測定

實驗中選擇深圳海域常見的赤潮爆發藻——錐狀斯氏藻（，從深圳鹽田港海域中分離獲得），該藻屬于甲藻，廣泛分布于近岸和河口，爆發性增殖時可以引起水體局部缺氧，威脅海洋生物及水產養殖．

藻細胞培養使用的是f/2培養基，具體配方為（每升海水中含無機鹽含量）：NaNO3 37.5 mg，NaH2PO4 2.5 mg，Fe-EDTA 2.5 mg（FeCl31.6 g+ EDTA 0.9 g），鹽酸硫銨素5 μg，Biotin VH 0.025 μg，VB120.025 μg，CuSO4·5H2O 0.0098 μg，ZnSO4·7H2O 0.022 μg，CaCl2·6H2O 0.01 μg，MgCl2·4H2O 0.180 μg，Na2MoO4·2H2O 0.0063 μg，培養溫度（21±1）℃、光照強度3000Lx、光暗比12h:12h．藻細胞在250 mL（裝液量150 mL）錐形瓶中進行．根據錐狀斯氏藻的生產周期曲線，待錐狀斯氏藻生長至對數期（約為第1次接種后的6~8d），取上層藻液移至新的錐形瓶中進行試驗．

藻細胞葉綠素和光合效率的測定采用浮游植物分類熒光儀（PHYTO-PAM）進行．具體操作如下，取2mL藻液裝入測量杯，對藻體進行5min暗適應，打開Phyto-PAM調制脈沖熒光儀波長為520nm強度為0.1 μmol/(m2?s)的褐色檢測光．測量過程由Phytowin軟件控制，開啟測量光（ML），待光信號穩定后打開飽和脈沖鍵，記錄Fv/Fm值，即為光合效率yield值．葉綠素水平（ChII）直接從儀器上讀取．

1.3 改性粘土的制備

本次試驗選用鈉性蒙脫土作為粘土[15]，選擇2種改性劑：十六烷基三甲基溴化銨和三丁基十六烷基溴化磷進行改性粘土的制備．

改性粘土的制備：取100mg的改性劑，加入10mL1%的稀鹽酸溶液，攪拌或震蕩使改性劑溶解，隨后加入過濾海水100mL，得到1mg/mL的改性劑鹽酸溶液，再稱取1g鈉性蒙脫土，邊攪拌邊加入100mL的改性劑鹽酸溶液，即配置出改性粘土[12]．相比以往以超純水為溶劑的做法，我們以海水為溶劑進行配置，目的是擴大改性粘土的使用范圍；其次是制備的改性粘土能更好的匹配海水環境．

1.4 抑藻菌株的分離與鑒定

菌株分離與篩選來自藻際共生微生物，菌株培養方法使用海水2216E培養基；藻際微生物分離自深圳東涌野外爆發的赤潮樣品．使用2216E培養基分離培養獲得單克隆菌株，純化后與藻細胞進行共培養，檢測藻細胞的葉綠素含量，挑選有抑制能力的菌株．試驗中分離得到兩種具有較強抑藻能力的菌株G4和J8．

細菌的鑒定采用16sRNA方法進行．提取菌株的總DNA作為基因擴增模板，采用通用引物進行擴增．正向引物為：27f: 5'-AGAGTTTGATCMTGG CTCAG-3'；反向引物為：1492R: 5'-TACGGYTACC TTTGTTACGACTT-3'，于30μL 反應體系中進行，反應體系如下：H2O（17μL），Buffer（3μL），d NTP （2μL），Primer1（3μL），Primer2（3μL），DNA模板（1μL），以及Taq酶（1μL）．反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1min，共35個循環；72 ℃延伸10 min．PCR 產物用1%凝膠電泳檢測，電泳條件：3μL樣品+1%瓊脂糖凝膠，Marker條帶組成：100、250、500、750、1000、2000、3000和5000bp．測序工作由北京六合華大基因科技有限公司完成；序列分析通過比對美國國家生物技術信息中心NCBI數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）完成．

鑒于16s rDNA序列同源性分析結果，鑒定的2株菌株結果為：蠟樣芽孢桿菌，簡稱G4；紡錘形賴氨酸芽孢桿菌，簡稱J8．兩者的序列比對相似性均為99%．

1.5 改性粘土對藻細胞的沉降作用

取實驗室傳代培養的藻種 (初始密度為5.4×105cells/mL)，分裝于21個100mL的錐形瓶中（每瓶裝液50mL）．試驗設3個測試組（每組3個平行），3個測試組分別為：空白組:（不含改性粘土和抑藻細菌）；實驗組①: 十六烷基溴化銨改性粘土，濃度分別為15mg/mL（高）、10mg/mL（中）、5mg/mL（低）；實驗組②: 三丁基十六烷基溴化磷改性粘土，濃度分別為：30mg/mL（高）、20mg/mL（中）、10mg/mL（低）．上述分組每個濃度3個平行．

將以上分組的藻細胞培養瓶震蕩搖勻，于（21±1）℃、光照強度3000Lx、光暗比12h:12h環境下培養觀察，每24h觀察藻液澄清度和沉降程度．

1.6 改性粘土對藻細胞光合效率和葉綠素的影響

取實驗室傳代培養的藻種（初始密度為5.4×105cells/mL），分裝于9個100mL的錐形瓶中（每瓶裝液50mL）．試驗設3個測試組（每組3個平行）．3個測試組分別為空白組（不含改性粘土和抑藻細菌）、實驗組1（含10mg/mL三丁基十六烷基溴化磷改性粘土）、實驗組2（含10mg/mL十六烷基溴化銨改性粘土）．將以上細胞培養瓶震蕩搖勻，于（21±1）℃、光照強度3000Lx、光暗比12h:12h環境下培養觀察，每24h監測液體中藻細胞濃度和葉綠素含量．

1.7 改性粘土與抑藻菌的耦合抑藻效果

取實驗室傳代培養的藻種（初始密度為5.4×105cells/mL），分裝于9個100mL的細胞培養瓶中（每瓶裝液50mL）．試驗設3個測試組（每組3個平行）．3個測試組分別為空白組（不含改性粘土和抑藻細菌）、實驗組1（含10mg/mL十六烷基溴化銨改性粘土和G4細菌）、實驗組2（含10mg/mL十六烷基溴化銨改性粘土和J8細菌），菌液終濃度為1×106cells/mL．將以上細胞培養瓶輕輕搖勻，于（21±1）℃、光照強度3000Lx、光暗比12h:12h環境下培養觀察，每24h監測液體中藻細胞濃度和葉綠素含量．

2 結果與討論

2.1 改性粘土對藻細胞的沉降作用

改性粘土對藻細胞有明顯的絮凝作用，隨著濃度的提高其絮凝效果更顯著．從表1中可以看出，十六烷基溴化銨改性粘土在高濃度（15mg/mL）時沉降作用最為明顯，沉降率90%；中濃度（10mg/mL）時次之，沉降率70%；低濃度（5mg/mL）效果最不顯著，沉降率不足50%．這一結果表明十六烷基溴化銨的加入對藻細胞有明顯的沉降作用，且呈現劑量依賴性．相比于十六烷基溴化銨，三丁基十六烷基溴化磷對藻細胞的沉降效果如表2所示，它對藻細胞的沉降率也呈現劑量依賴性，但對藻類的沉降效果略遜于十六烷基溴化銨．

文獻[11]使用蛭石（vermiculite）抑制銅綠微囊藻，證實在3h內藻的去除率可達80%以上．文獻[16]使用鑭膨潤土（lanthanum-bentonite）抑制藻類，發現它具有更廣譜的抑藻效果，對甲藻、硅藻和部分綠藻都有作用，這主要得益于鑭膨潤土對磷的吸附能力，從而高效地控制藻類生長．本次試驗中十六烷基溴化銨的主要作用在于絮凝作用，將藻細胞吸附形成局部高濃度，加速藻的沉降，該作用可在24h后體現，并可維持超過120h．相比于蛭石和鑭膨潤土，粘土物質的沉降作用有一定的時效性，它沒有對藻類進行徹底殺滅，存在反彈的可能．因此，該類方法宜作為控藻的第一步，需配合生物消殺法一起使用[17]．

2.2 改性粘土對藻細胞光合效率和葉綠素的影響

基于表1和表2的結果，從整體抑藻和劑量成本考慮，對于2種改性粘土，我們均選擇了中濃度（10mg/mL）進行后續的實驗．添加2種改性粘土到培養液當中，對藻類抑制的結果如圖1所示．從圖1可以看出早期十六烷基溴化銨改性粘土對藻細胞有明顯抑制作用，其光合效率（Fv/Fm）值在24 h后降到了0.07，但隨著時間的延長藻細胞Fv/Fm值有明顯的反彈，至120h后與對照組基本相似（Fv/Fm值分別為0.52和0.51）．而三丁基十六烷基溴化磷改性粘土對藻細胞的光合效率沒有很明顯的抑制作用，其Fv/Fm值與對照組基本持平．添加2種改性粘土的藻液中，對藻細胞葉綠素的影響如圖2所示．我們觀察到光合效率的下降主要是由于改性粘土的存在影響了藻對光的吸收，這與文獻[18]的結果一致，他們也證實改性粘土能顯著降低亞歷山大藻（）的光合效率，并減少藻毒素的分泌．

表1 十六烷基溴化銨對藻細胞的沉降效果

表2 三丁基十六烷基溴化磷對藻細胞的沉降效果

圖1 改性粘土對藻細胞光合效率的影響

從圖2可以看出實驗組在整個實驗周期中（24~168h，間隔24h），葉綠素a的含量為208.31~286.82 μg·L-1．當添加三丁基十六烷基溴化磷改性粘土后，葉綠素濃度在24h后有明顯降低，其值為107.23 μg·L-1；而從48h后，葉綠素的降低效果出現反彈，其值變化幅度為：176.41~234.93 μg·L-1．相比之下十六烷基溴化銨改性粘土對藻細胞葉綠素有明顯的抑制作用，與對照相比在整個實驗周期中降低了20倍以上．值得一提的是三丁基十六烷基溴化磷是一種中性化合物，對環境低毒，不會造成二次污染．文獻[19]也強調粘土的使用應注重生物毒性和非生物毒性，他們證實了粘土類在水庫的生態修復中不會引起魚類的急性毒性，也不會造成組織學傷害，是一種環境友好型方法．

綜合圖1和圖2的結果，我們可以看到十六烷基溴化銨改性粘土的效果更好，因而在后續的耦合實驗中，我們選擇了該種改性粘土進行后續的實驗．

2.3 改性粘土與抑藻細菌的耦合抑藻效果

耦合法使用后對藻類抑制的結果如圖3所示．對照組光合效率Fv/Fm值在整個試驗周期中的變化幅度在0.38-0.56之間，而2個實驗組“十六烷基溴化銨改性粘土+G4”和“十六烷基溴化銨改性粘土+J8”對藻細胞的光合效率有明顯的抑制作用，其Fv/Fm值在0.01~0.02的范圍，部分時間點（如72h和96h）光合效率降低到0．

耦合法對藻類葉綠素含量的影響結果如圖4所示．通過圖4可以看出改性粘土和菌種（G4和J8）的聯合使用對藻細胞有明顯抑制作用，持續抑藻時間可達168h，未見藻細胞數量的反彈．從整個實驗周期（24~168h，間隔24h）來看，對照組葉綠素的含量在205.2~340.63μg/L．當耦合使用后，葉綠素濃度在24h后有明顯降低，其值在兩個實驗組中的范圍為68.59-95.2μg/L；而從48h后，葉綠素的降低效果出現保持，至實驗終點時其葉綠素值低于20μg/L水平，且全程未見反彈．

圖3 耦合法對藻細胞光合效率Fv/Fm的影響

圖4 耦合法對藻細胞葉綠素a的影響

圖5 空白組（a）與耦合組（b）藻細胞的形態特征

此外，我們通過顯微觀察比較了實驗組與對照組藻細胞的形態特征（圖5）．從圖5可知，對照組藻細胞形態完整，細胞輪廓清晰，著色均勻；而耦合組藻細胞出現裂解、細胞空殼化嚴重，形態碎裂，大部分細胞被溶藻細菌G4或J8殺滅．

從上述的結果可以看出，耦合溶藻菌的使用后，抑藻效果得到明顯加固，藻類出現裂解、空泡化和殘缺化，抑藻作用不反彈．文獻[20]發現改性粘土的作用在于團聚藻細胞形成局部高密度而沉降藻類，它不能對藻細胞產生直接殺滅；需配合生物法或化學法來進行二次消殺，以徹底控制藻類的再次滋生．文獻[21]采用船載實驗的方法證實了文獻[20]的觀點，提出了微生物耦合法、紫外光照耦合法、天然產物耦合法等多種可能．本實驗采用的是微生物耦合法，2種溶藻菌株菌來自藻類共生菌，不會帶來外源物種入侵的風險，也不會對本土環境造成生態沖擊，是一種相對安全的方法．

3 結 論

1）改性粘土對藻細胞有明顯的絮凝作用，且呈現劑量依賴性．十六烷基溴化銨的抑制作用優于三丁基十六烷基溴化磷．

2）改性粘土和抑藻菌株（G4和J8）的聯合使用對藻細胞有明顯抑制作用，持續抑藻時間可達168h，未見葉綠素a含量的明顯反彈．

3）實驗篩選的抑藻菌株來源于自然環境，將其與物理法耦合使用，不會帶來外源物種的侵襲風險，且可以將物理法的抑藻效果鞏固和持續，是一種環保型赤潮藻防控方法．

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A Method to Controlby Combining the Modified Clay and Algicidal Bacteria

WANG Yan1, WU Fan1, ZHANG Qin2

（）

In order to develop a highly efficient and environment-friendly algal inhibition method, the effect of two kinds of modified clay (sixteen alkyl three methyl ammonium bromide and three butylsixteen alkyl bromide) combined with algae inhibition bacteria on killingwas studied. The result showed that the inhibitory effect of sixteen alkyl three methyl ammonium bromide was better than that of three butyl sixteen alkyl bromide when the modified clay was used alone, but only in the initial stage (48 hours). However, the algae cells were not completely removed. When the modified clay was coupled with algae inhibition bacteria (G4 andJ8), the effect of algae inhibition was obvious and persistent, and the effective algal inhibition time could last up to 168 hours without obvious rebound of chlorophyll concentration. Therefore, our study shows that the combined use of methyltrimethyl -ammonium bromide modified clay and algal inhibition bacteria can be used as a potential environment-friendly method to control harmful alage.

modified clay; algicidal bacteria;; harmful alage

10.13899/j.cnki.szptxb.2019.01.012

2018-07-11

深圳市科技創新委計劃資助項目（JCYJ20170817160708491，CYZZ20170331112457200）

王艷（1965-），女，吉林人，碩士，副教授，主要研究方向：自然與哲學．

X55

A

1672-0318（2019）01-0058-06