葡萄釀制過程中5種殺菌劑的殘留變化

章麗君，章 虎，徐明飛，林春綿，吳慧珍，徐 杰，錢鳴蓉，*

(1.浙江工業大學 環境學院，浙江 杭州 310032； 2.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021； 3.浙江樹人大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州 310015)

食品安全問題日益成為全社會關注的焦點。農藥在水果、蔬菜等食品中的殘留問題是近年社會民生熱點之一，葡萄酒中潛在的農藥殘留風險也不容忽視[1-4]。農藥可用于保護作物免受外生生物的侵害，但過高的殘留水平可能會對人體健康造成危害[5-6]。目前，中國國家食品安全標準中未有關于葡萄酒中農藥最大殘留限量(MRL)的規定。隨著公眾對食品安全標準要求的提高，以及家釀葡萄酒在民間的普及，有必要對典型殺菌劑在葡萄家釀過程中的殘留變化進行研究，為家釀葡萄制酒過程中殺菌劑殘留風險評估提供基礎數據，以確保消費者的飲用安全。同時，針對家釀葡萄酒過程中殺菌劑殘留變化的研究，也可作為優化家釀過程，降低殺菌劑在酒汁中殘留量，促進家釀葡萄酒健康消費的重要依據。Cabras等[7]指出，葡萄酒中某些農藥的殘留水平不僅與藥物化學性質有關，還與釀酒工藝中酵母菌的活性相關。此外，葡萄酒中農藥殘留還受釀造工藝、環境條件等因素的影響[8-10]。文獻顯示，葡萄酒在釀造過程中，酒泥中的農藥殘留水平遠高于葡萄酒汁中[11-14]。本研究采用高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)測定腈菌唑、雙炔酰菌胺、噁唑菌酮、丙環唑和苯醚甲環唑5種常見殺菌劑在葡萄家釀過程中的殘留變化，并考查了酵母菌添加對其的影響，以期為相關研究提供基礎資料與數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紅葡萄，取自杭州地區葡萄種植基地；RW安琪紅葡萄酒果酒專用酵母，安琪酵母股份有限公司；D254釀酒酵母，法國Lalvin公司。固相萃取柱，HLB 6cc(200 mg)，Waters。色譜級甲醇，德國Merck公司；乙酸(純度≥99.7%)，美國Sigma-Aldrich公司。殺菌劑標準品均購于德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司：腈菌唑，純度99.5%；噁唑菌酮，純度99.0%；雙炔酰菌胺，純度98.5%；丙環唑，純度99.0%；苯醚甲環唑，純度98.7%。

1.2 實驗儀器

HPLC-MS/MS: Surveryor高效液相色譜，TSQ Quantum Discovery三重四級桿質譜，美國Thermo Fisher Scientific公司。QT-2型漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司；KQ5200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。BSA822-CW電子分析天平(精確至0.01 g)，德國Satorius公司。

1.3 實驗方法

田間噴藥。參照《農藥登記殘留田間試驗標準操作規程》和杭州地區操作經驗，依據氣候和病害情況，在6月進行葡萄上的農藥噴施。殺菌劑均以參照農藥登記最高劑量的1.5倍施藥：腈菌唑(美國陶氏益農公司40%可濕性粒劑)，用藥量150 mg·kg-1，噴霧；噁唑菌酮(美國杜邦公司6.25%水分散粒劑)，用藥量1 800倍液，噴霧；雙炔酰菌胺(瑞士先正達作物保護有限公司23.4%懸浮劑)，用藥量250 mg·kg-1，噴霧；對苯醚甲環唑和丙環唑，參照苯醚甲環唑最高劑量1.5倍施藥(苯醚甲環唑和丙環唑混劑，四川貝爾化工集團有限公司30%水乳劑，苯醚甲環唑和丙環唑各15%)，用藥量80 mg·kg-1，噴霧。每個處理設平行小區3個，每小區面積60 m2，另設對照區1個。

釀酒過程。采摘施藥14 d后的成熟葡萄以及空白組(未施藥)葡萄用于釀酒試驗。用剪刀貼近果蒂處把葡萄剪下來，選取成熟、新鮮、無病蟲、無腐爛，品質好的葡萄，去除癟粒、霉粒、青粒。設3個實驗處理：CK，施藥葡萄發酵；D254，施藥葡萄+D254釀酒酵母發酵；RW，施藥葡萄+RW安琪紅葡萄酒果酒專用酵母發酵，每處理重復3次。另取未施藥葡萄作空白對照。具體操作如下：將5 kg葡萄樣品擠破，葡萄肉和葡萄皮擠碎后放到主發酵容器中(裝樣量不超過容器的70%)，將發酵容器置于陰涼、通風、室溫(25 ℃)條件下：1～9 d為初發酵過程，于第2天向各處理中加入0.1 kg白糖并攪拌均勻，并在D254和RW處理的發酵罐中分別加入1 g D254釀酒酵母或1 g RW安琪紅葡萄酒果酒專用酵母，于第4天重復第2天的加糖和攪拌操作，初發酵期間每天用消毒過的玻璃棒攪動樣品；9 d后為后發酵過程，利用虹吸法，用膠管將葡萄酒汁倒入二次發酵器，用細紗布過濾葡萄皮、籽、糟等，濾液并入二次發酵容器中，發酵容器留有1/10空隙，封蓋處保留縫隙。按照以上發酵過程，在實驗開始前，和實驗開始后1、3、5、7、9、15、21、26 d分別取發酵汁液和初發酵過程中的葡萄渣樣品，發酵酒汁樣品不少于20 mL，葡萄渣樣品不少于20 g，取樣前充分振搖發酵容器。樣品采集后，立即低溫(-20 ℃)保存。

1.4 分析方法

樣品前處理。葡萄酒汁樣品經解凍后取5 mL于50 mL離心管中，加入10 mL去離子水渦旋混合，調節pH至3.6。離心后將15 mL混合液轉移至HLB(200 mg)固相萃取柱中(使用前，先后用5 mL甲醇、5 mL乙酸調節pH至3.6的去離子水活化凈化柱)，去離子水洗滌小柱后用5 mL甲醇洗脫，洗脫液經0.22 μm 有機濾膜過濾，用HPLC-MS/MS進行分析。稱取葡萄渣樣品15 g搗碎勻漿，加入15 mL經1%乙酸酸化的乙腈，混合物渦旋后超聲15 min，再加入6 g無水硫酸鎂、1.5 g無水醋酸鈉，迅速振搖5 min，離心，將上層乙腈提取物轉移至含有 50 mgN-丙基乙二胺(PSA)、50 mg C18和150 mg無水硫酸鎂的離心管中，渦旋混合并離心，再取0.5 mL上層乙腈提取物轉移至含有0.5 mL去離子水的離心管中，渦旋均勻，過0.22 μm有機濾膜后待測。HPLC-MS/MS分析條件詳見表1。

2 結果與分析

2.1 分析方法驗證

采用2.5、5、10、50、250 μg·L-1系列濃度構建標準曲線，外標法進行定量。以離子信噪比為3∶1和10∶1分別計算5種殺菌劑的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)。通過日內重復性和日間重復性確定方法的精確度，以相對標準偏差(RSD)表示。對于日內重復性，同一天分析添加濃度為2.5、5、50、250 μg·kg-1的樣品5次；對于日間重復性，連續3 d分析添加濃度為2.5、5、50、250 μg·kg-1的樣品。

將目標殺菌劑添加到空白葡萄酒汁及葡萄渣樣品進行重復實驗。結果表明，本文所用的檢測方法具有良好的線性(R2>0.999)，在供試濃度水平下，5種殺菌劑在葡萄酒汁中的回收率為75.4%～112.5%(表2)，在葡萄渣中的回收率為87.1%～105.5%(表3)。

2.2 釀酒過程中5種殺菌劑的殘留變化

如圖1所示，家釀過程中無論是否添加酵母，腈菌唑和雙炔酰菌胺殘留水平都先下降再上升接著下降，之后處于較穩定水平。分析原因，可能是發酵前3 d速度較緩慢，酒汁中腈菌唑和雙炔酰菌胺的含量受降解的影響；隨著發酵進行，葡萄果肉中的腈菌唑和雙炔酰菌胺逐漸遷移至汁中，所以在5 d時顯示濃度升高；之后腈菌唑和雙炔酰菌胺的降解幅度逐漸強于遷移作用，7 d時顯示濃度下降；至9 d時，二者濃度又回升，尤其是添加酵母的處理，其酒汁中雙炔酰菌胺濃度高于初始濃度；9 d后濾出葡萄渣，初發酵結束，殺菌劑濃度處于穩定水平。酒汁中的噁唑菌酮濃度先上升再下降然后趨于穩定。發酵3 d，可能由于果肉中噁唑菌酮的遷移起主導作用，殘留水平呈上升趨勢；之后隨著發酵的進行，噁唑菌酮的降解作用逐漸占優勢，殘留水平開始下降。

表1HPLC-MS/MS分析條件

Table1HPLC-MS/MS analysis conditions

殺菌劑Fungicide色譜條件Chromatographic conditions色譜柱Column柱溫Columntemperature/℃流速Flow rate/(mL·min-1)流動相Mobilephase質譜參數MS/MS conditions定量離子Quantita-tiveion碰撞能Collisionenergy/eV定性離子Qualita-tiveion碰撞能Collisionenergy/eV腈菌唑Luna C18250.290% CH3OH289>7015289>12520Myclobutanil(5 μm)噁唑菌酮392>3317392>23814Famoxadone雙炔酰菌胺412>32815412>12527Mandipropamid丙環唑342>15929342>6931Propiconazole苯醚甲環唑406>25123406>18839Difenoconazole

表2五種殺菌劑在葡萄酒汁中的回收率

Table2Recovery rate of 5 fungicides in grape wine

殺菌劑Fungicide添加濃度Concentration/(μg·kg-1)日內回收率(n=5)Intraday recovery rate/%(RSD)1 d2 d3 d日間相對標準偏差(n=3)Interday RSD/%LOD/(μg·kg-1)LOQ/(μg·kg-1)腈菌唑2.593.4 (1.2)96.9 (1.8)91.8 (6.0)2.20.51.5Myclobutanil584.9 (2.3)86.9 (5.5)94.1 (5.7)7.25094.8 (4.4)94.1 (3.5)97.1 (7.9)0.4250108.9 (0.4)110.7 (1.8)108.6 (4.6)3.8噁唑菌酮2.582.8 (9.7)76.1 (1.9)75.9 (1.4)7.40.31.0Famoxadone575.4 (4.3)82.8 (8.6)86.2 (2.7)9.75076.7 (1.1)75.6 (7.1)83.5 (5.8)3.425076.7 (0.6)82.8 (9.8)85.6 (4.8)7.3雙炔酰菌胺2.5102.5 (9.3)98.5 (8.8)98.1 (8.2)2.40.82.5Mandipropamid593.4 (2.7)96.9 (7.7)101.9 (0.4)4.45092.0 (2.3)94.2 (1.2)93.1 (3.1)1.225092.3 (1.3)96.0 (6.6)95.4 (7.5)2.1丙環唑2.5100.5 (9.5)107.8 (0.7)106.9 (1.8)4.40.51.5Propiconazole592.7 (4.6)96.2 (0.7)102.9 (8.5)8.650101.8 (2.1)104.9 (2.8)105.9 (0.9)1.525085.6 (8.5)89.8 (1.6)90.6 (2.8)3.0苯醚甲環唑2.598.2 (2.4)102.2 (3.3)103.2 (1.9)2.70.31.0Difenoconazole589.1 (4.5)94.9 (2.5)98.3 (5.7)5.450104.4 (7.7)112.5 (3.0)112.5 (3.1)4.225099.6 (5.2)103.7 (0.7)109.3 (6.5)4.7

回收率數據后括號中的數字表示相應的相對標準偏差。下同。

Data in bracket after recovery rate was the according relative standard deviation (RSD). The same as below.

表3五種殺菌劑在葡萄渣中的回收率

Table3Recovery rate of 5 fungicides in grape sediment

殺菌劑Fungicide添加濃度Concentration/(μg·kg-1)日內回收率(n=5)Intraday recovery rate/%(RSD)1 d2 d3 d日間相對標準偏差(n=3)Interday RSD/%LOD/(μg·kg-1)LOQ/(μg·kg-1)腈菌唑2.599.9 (1.7)96.2 (6.4)94.1 (6.5)3.00.51.5Myclobutanil598.2 (5.4)99.7 (8.9)99.6 (4.7)0.850103.7 (1.7)94.5 (6.7)96.6 (3.9)4.925098.6 (4.2)100.8 (0.7)100.7 (4.5)1.2噁唑菌酮2.597.4 (8.1)95.0 (7.5)95.7 (5.0)1.20.62.0Famoxadone597.4 (4.1)97.9 (1.6)98.3 (2.7)0.550101.2 (4.9)96.7 (3.1)100.4 (1.7)2.425097.8 (1.1)98.9 (2.5)100.0 (2.7)1.1雙炔酰菌胺2.587.1 (9.2)101.7 (2.8)95.1 (8.0)7.30.31.0Mandipropamid598.2 (7.1)103.6 (9.1)99.9 (4.3)2.85096.5 (6.6)105.5 (2.9)92.7 (2.8)6.525099.0 (5.6)104.7 (9.2)99.7 (6.5)3.1丙環唑2.596.1 (7.6)93.4 (3.6)97.6 (5.6)2.10.31.0Propiconazole598.8 (5.2)96.1 (4.7)102.7 (4.7)3.35092.3 (5.9)92.7 (4.8)95.9 (2.6)2.025096.4 (6.5)93.5 (5.5)99.2 (2.0)2.8苯醚甲環唑2.597.4 (3.4)101.7 (3.8)93.8 (2.1)4.00.51.5Difenoconazole599.1 (2.5)95.9 (4.5)97.6 (7.5)1.650103.2 (5.7)100.4 (5.9)101.2 (6.1)1.425099.0 (5.6)95.7 (6.7)98.7 (5.4)1.8

圖1 五種殺菌劑在葡萄家釀過程中的殘留變化Fig.1 Dynamic changes of five fungicides residue in homemade wine fermentation process

丙環唑與腈菌唑及雙炔酰菌胺的濃度變化趨勢一致，而苯醚甲環唑濃度則一直呈下降趨勢，于9 d后趨于穩定。

取初發酵結束時的葡萄渣，測定其中5種殺菌劑的殘留量，結果如表4所示，各處理之間無顯著差異。總體來看，添加酵母菌對葡萄酒家釀過程中5種殺菌劑的殘留變化無顯著改變，5種殺菌劑的殘留變化差異可能主要源于其理化性狀差異。

王玉路等[15]研究表明，初發酵(酒精發酵)過程中，發酵液中目標農藥無明顯降解，其降解主要發生在二次發酵和陳釀期過程。本研究顯示，家釀初發酵過程中不同殺菌劑的遷移與降解有差異，且在二次發酵過程中，5種殺菌劑殘留水平都呈現穩定趨勢。這可能是因為不同研究所采用的釀造工藝不同。家釀葡萄酒步驟操作簡單，且未使用亞硫酸進行殺菌抗氧化。

表4發酵9 d后葡萄渣中5種殺菌劑的殘留量

Table4Residue levels of 5 fungicides in grape residue after 9 d fermentation μg·kg-1

3 結論

本研究以噴施藥劑的葡萄為材料，探索了葡萄酒家釀過程中殺菌劑殘留的動態變化。結果表明，在初發酵過程，不同殺菌劑呈現了不同程度的降解，至初發酵結束，腈菌唑和雙炔酰菌胺在添加酵母菌的發酵體系中沒有呈現明顯降解趨勢。在二次發酵過程中，5種殺菌劑殘留含量趨穩。5種殺菌劑的遷移水平和降解趨勢均存在差異，但添加酵母對其無顯著影響。