羊口瘡病毒安徽株023基因的原核表達與生物信息學分析

張高峰，楊侃侃，張 謙，王元紅，俞趙榮，張學琪，魯智敏，劉自敏，李永東，王 勇，*

(1.安徽農業大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036； 2.寧波市疾病預防控制中心，浙江 寧波 315010)

羊口瘡(orf)是由羊口瘡病毒(orf virus，ORFV)引起的急性接觸性人獸共患傳染病，主要感染綿羊、山羊和駱駝等。屠夫、飼養員和獸醫等人群也有感染發病的報道[1-4]。該病臨床表現以口唇、舌、乳房等部位形成丘疹、膿皰以及厚痂為主要特征[5]。各個年齡階段的綿羊和山羊都可被感染，羔羊發病率較成年羊高。由于病變部位大多出現在口唇周圍，嚴重影響了羔羊的吸吮和采食[6]。該病最早于1920年首次在歐洲出現，目前世界上所有養羊的地區均有該病的發生，我國也不例外，因此對畜牧業造成了嚴重的經濟損失[7-8]。

ORFV屬于痘病毒科、副痘病毒屬的成員，為線性雙鏈DNA病毒，基因組大小約138 kb，G+C含量約64%，編碼132個基因。基因組的中央區域為高度保守的基因，在病毒復制時起重要作用，而末端區域的基因則在病毒毒力及致病機制中起關鍵作用[9-10]。目前為止，ORFV基因組大多數基因的功能還未研究，其中包括位于基因組保守區域的023基因，僅有研究人員預測該基因編碼的蛋白可能為囊膜蛋白[11]。本試驗擬克隆表達ORFV安徽株023基因，表達023蛋白并制備鼠源多抗血清，并預測該蛋白的基本特性，以期為進一步研究ORFV 023基因的生物學功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ORFV AH-F10株[12]、pET-32a(+)菌種由本實驗室保存。BALB/c小鼠購自安徽醫科大學實驗動物中心。pMDTM18-T載體購自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒；SolutionⅠ；DH5α和Rosseta感受態細胞；2×LA rTaq酶、限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ；質粒提取試劑盒；PBS緩沖液；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒；DAB試劑盒；ECL試劑盒；抗His標簽的鼠源一抗、HRP標簽的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；弗氏佐劑購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設計與基因擴增

按病毒基因組提取試劑盒說明書提取ORFV AH-F10株DNA。根據GenBank中發表的ORFV GO株基因序列，設計023基因特異性引物，上游引物：5′-CGGGATCCATGGTGGACAGCGGCACG-3′(下劃線處為BamHⅠ酶切位點)；下游引物：5′-GGAATTCCTACAGCAGCACCACGTTCTC-3′(下劃線處為EcoRⅠ酶切位點)。

PCR反應體系(20 μL)：2×LArTaq10 μL、ddH2O 7 μL、DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR產物回收后克隆至pMDTM18-T載體，轉化DH5α感受態細胞，涂布至氨芐抗性的固體培養基，隔天挑取陽性克隆提取質粒，命名為pMDTM18-T-023，送至上海邁浦生物科技有限公司測序。

1.3.2 重組質粒pET-32a(+)-023構建

將pMDTM18-T-023與pET-32a(+)空載體質粒經內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后電泳，產物回收后連接pET-32a(+)載體，轉化DH5α感受態細胞，涂布至氨芐抗性的固體培養基，隔天挑取陽性菌落提質粒，命名為pET-32a(+)-023，雙酶切鑒定后送到上海邁浦生物科技有限公司測序。

1.3.3 重組蛋白的誘導表達

將pET-32a(+)-023與pET-32a(+)空載體質粒分別轉化Rosetta感受態細胞，接種至氨芐抗性的固體培養基，分別挑取單菌落至LB液體培養基。當D600值在0.6～0.8時，加入1 mmoL·L-1的IPTG于37 ℃、180 r·min-1誘導表達，取5 h樣品SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色。對誘導成功的重組菌進行大量誘導，4 ℃離心收集樣品于冰浴下超聲裂解，分別收集上清和沉淀分析重組蛋白的可溶性。

1.3.4 重組蛋白的純化

將收集的蛋白用PBS緩沖液重懸，隨后4 500 r·min-1離心10 min，收集沉淀并用Tris緩沖液洗滌，4 ℃ 8 000 r· min-1離心10 min，棄上清。沉淀依次用含2、4、5和6 mol·L-1尿素的Tris緩沖液吹打洗滌，4 ℃ 8 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀用含8 mol·L-1尿素的Tris緩沖液重懸，4 ℃靜置過夜。12 000 r·min-1離心10 min收集上清至透析袋中，用含6、5、4、2和0 mol·L-1尿素的Tris緩沖液進行復性。蛋白復性后用蔗糖濃縮。

1.3.5 Western-blot檢測

將純化后的蛋白SDS-PAGE電泳后轉膜至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，TBST洗滌3次；加入1∶200稀釋的鼠源抗ORFV多抗血清作為一抗，37 ℃孵育1 h后TBST漂洗3次。再加入1∶1 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育1 h后TBST漂洗3次。利用ECL發光試劑盒顯色。

1.3.6 鼠源多抗血清的制備

純化的蛋白50 μg·只-1免疫BALB/c雌性小鼠，過程如下：首次免疫時將蛋白與等體積完全佐劑混勻乳化后皮下注射；14 d后二免，二免時將蛋白與等體積不完全佐劑混勻乳化后皮下注射；二免后14 d和28 d進行三免和四免，方法同第二次。四免7 d后眼眶采血分離血清。

1.3.7 ORFV 023蛋白的生物信息學分析

利用ProtparamSOPMA在線程序分析該毒株023蛋白的理化性質；利用SOPMA在線程序分析該毒株023蛋白的二級結構；利用SingalP4.1在線程序預測該蛋白的信號肽；利用TMHMM2.0 Server在線程序預測該蛋白的跨膜結構域；利用NetPhos3.1 Server在線程序預測該蛋白的磷酸化位點；利用DNAStar的Protean程序預測023蛋白的B細胞表位；利用nHLAPred的ComPred在線服務器預測023蛋白的CTL表位；利用ProPred在線服務器預測023蛋白的Th表位。

2 結果與分析

2.1 023基因的擴增

經特異性引物擴增的023基因長約819 bp(圖1)，與預期結果相符，測序分析表明并未發生堿基突變或缺失。

2.2 重組質粒pET-32a(+)-023的雙酶切鑒定

將pET-32a(+)-023重組質粒經內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳，得到符合預期的條帶(圖2)，測序表明成功構建重組質粒，堿基并未發生突變或缺失。

2.3 重組蛋白的SDS-PAGE分析

將pET-32a(+)-023質粒轉化至Rosetta細胞內，成功表達約為42 ku的蛋白，與預期相符，SDS-PAGE結果顯示蛋白主要以包涵體存在于沉淀中(圖3)。

2.3 Western-blot鑒定

利用Western-blot對蛋白進行進一步分析，結果顯示在硝酸纖維素膜上約42 ku處有一明顯條帶(圖4)，表明重組蛋白能成功被抗His標簽的一抗識別，具有良好的反應原性。

M，DNA marker；1，陰性對照；2，023基因PCR產物。M， DNA marker; 1， Negative control; 2， 023 gene PCR product.圖1 023基因擴增產物Fig.1 PCR product of 023 gene

M，DNA marker；1，pET-32a(+)-023重組質粒雙酶切產物；2，pET-32a(+)空載體陰性對照。M， DNA marker; 1， pET-32a(+)-023 recombinant plasmid double digested product; 2， pET-32a(+)empty vector negative control.圖2 重組質粒pET-32a(+)-023雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-32a(+)-023 by double enzyme digested

M，蛋白Marker；1，pET-32a(+)空載體經IPTG誘導；2，pET-32a(+)空載體未經IPTG誘導；3，pET-32a(+)-023重組質粒未經IPTG誘導；4，pET-32a(+)-023重組質粒經IPTG誘導；5，pET-32a(+)-023重組質粒誘導表達上清；6，pET-32a(+)-023重組質粒誘導表達沉淀。M， Protein marker; 1， pET-32a(+)empty vector was induced by IPTG; 2， pET-32a(+) empty vector was not induced by IPTG; 3， pET-32a(+)-023 recombinant plasmid was not induced by IPTG; 4， pET-32a(+)-023 recombinant plasmid was induced by IPTG; 5， pET-32a(+)-023 induced expression supernatant; 6， pET-32a(+)-023 induced expression precipitate.圖3 pET-32a(+)-023蛋白產物SDS-PAGE電泳Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of the protein product of pET-32a(+)-023

2.4 鼠源多抗Western-blot鑒定

純化蛋白以鼠源抗ORFV陽性血清為一抗，HRP標簽的羊抗鼠IgG為二抗進行Western-blot鑒定，結果顯示重組蛋白能夠被抗ORFV陽性血清特異性識別(圖5)。

2.5 理化性質分析

利用Protparam在線程序分析該毒株023蛋白的理化性質，結果顯示，該蛋白由272個氨基酸組成，分子式為C1437H2157N357O399S7，相對分子質量為31 042.51 ku，理論pI(等電點)值為6.97，不穩定系數為37.08，平均親水值(GRAVY)為-0.132，為親水性穩定蛋白，帶負電荷的氨基酸(Asp+Glu)和帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)各26個，脂肪族系數為81.40。

M，蛋白marker；1，pET-32a(+)-023重組質粒經IPTG誘導表達；2，pET-32a(+)空載體經IPTG誘導表達。M， Protein marker; 1， pET-32a(+)-023 recombinant vector induced by IPTG; 2， pET-32a(+)empty vector induced by IPTG.圖5 多克隆抗體的鑒定Fig.5 Identification of polyclonal antibody

1，pET-32a(+)空載體經IPTG誘導表達；2，pET-32a(+)-023重組質粒經IPTG誘導表達。
1， pET-32a(+)empty vector induced by IPTG; 2， The recombinant plasmid pET-32a(+)-023 induced by IPTG.
圖4 Western-blot鑒定023蛋白的體外表達
Fig.4 Western-blot identification of 023 proteininvitro

2.6 二級結構分析

利用SOPMA在線程序預測023蛋白的二級結構，結果顯示，該蛋白二級結構包括α-螺旋(h，27.57%)，延伸鏈(e，17.28%)，β-轉角(t，12.13%)，無規則卷曲(c，43.01%)4種類型(圖6)。

2.7 信號肽、跨膜結構域及磷酸化位點的預測分析

分別利用SingalP4.1和TMHMM2.0 Server在線程序預測該蛋白的信號肽和跨膜結構域，結果顯示，023蛋白無信號肽區域和跨膜結構域(圖7、圖8)；利用NetPhos3.1 Server在線程序預測023蛋白的磷酸化位點，結果顯示，該蛋白共有30個磷酸化位點，其中絲氨酸位點13個，蘇氨酸位點11個，酪氨酸位點6個(圖9)。

2.8 B細胞抗原表位的預測分析

利用DNAStar的Protean程序預測023蛋白的B細胞抗原表位，結果顯示，該蛋白親水性位點主要位于第1～2、26～28、47～50、65～71、73～87、115～118、126～144、152～160、218～226、233～251、253～256、258～262、265～273處，含有柔韌性的區域主要位于第5～29、47～49、53～58、84～87、93～99、102～110、121～124、144～152、161～165、174～182、185～217、230～233、246～254、266～26處，抗原性和表面可及性程度較高。結合該蛋白的二級結構、親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性進行綜合分析，該蛋白第26～28、84～87、144～146、246～254等處可能存在優勢抗原表位(圖10、表1)。

圖6 羊口瘡病毒AH-F10株023蛋白的二級結構Fig.6 Secondary structure of ORFV AH-F10 strain 023 protein

圖7 羊口瘡病毒AH-F10株023蛋白的信號肽預測Fig.7 Signal peptide prediction of ORFV AH-F10 strain 023 protein

圖8 羊口瘡病毒AH-F10株023蛋白的跨膜結構域預測Fig.8 Transmembrane domain prediction of ORFV AH-F10 strain 023 protein

2.9 T細胞表位的預測分析

圖9 羊口瘡病毒AH-F10株023蛋白的磷酸化位點預測Fig.9 Phosphorylation site prediction of ORFV AH-F10 strain 023 protein

圖10 羊口瘡病毒AH-F10株023蛋白的B細胞表位預測Fig.10 Prediction of B cell epitopes of ORFV AH-F10 strain 023 protein

表1綜合分析ORFV 023蛋白B細胞抗原表位的位置

Table1Analysis of the location of the ORFV 023 protein B cell epitopes in combination with different data

方法Method位置Position二級結構Secondary structure 7～8、15～20、26～30、40～44、83～87、102～110、132～133、142～146、175～178、187～190、195～196、202～207、212～214、230～231、243～246、253親水性Hydrophilicity1～2、26～28、47～50、65～71、73～87、115～118、126～144、152～160、218～226、233～251、253～256、258～262、265～273柔韌性Flexibility5～29、47～49、53～58、84～87、93～99、102～110、121～124、144～152、161～165、174～182、185～217、230～233、246～254、266～26抗原性Antigenicity1～23、26～31、40～44、51～61、73～76、83～97、100～110、119～125、144～152、161～168、171～197、202～232、246～247、250～253表面可及性Surface probability1～272綜合分析Parameter analysis26～28、84～87、144～146、246～254

2.9.1 CTL表位預測

利用nHLAPred的ComPred在線服務器，將閾值調節為0.5，分別預測HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203和HLA-A*0205五種不同分子的結合肽(表2)，結果顯示，第154～162位的SLLGAVYTT、230～234位的RYDPV和237～242位的FLVFYV可能存在023蛋白的CTL表位。

2.9.2 Th表位預測分析

利用ProPred在線服務器分別預測DRB1-0101、DRB1-0102、DRB1-0301的Th表位(表3)，結果顯示，第74～76位的FEF、128～135位的LLLSSVPI、237～244位的LVFYVPGI可能存在023蛋白的Th表位。

表2羊口瘡病毒AH-F10株023蛋白的CTL細胞表位預測

Table2Prediction of CTL cell epitopes of ORFV AH-F10 strain 023 protein

等位片段Allele順序Rank起始位置Start position序列SequenceHLA-A2127GLSPLMRHT273KKFEFMFSL3154SLLGAVYTT4226LYYTRYDPVHLA-A*0201134HTYIYNNYA248ETALWSSRL361VTDFYPISL4128FLLLSSVPIHLA-A*02021218TLANLSTIL2234VLCFLVFYV3237FLVFYVPGL4261KLSLAPENVHLA-A*0203148ETALWSSRL261VTDFYPISL3128FLLLSSVPI4231YDPVLCFLVHLA-A*02051178DYKPLFSRL2237FLVFYVPGL343YGWIPETAL4226LYYTRYDPV

3 討論

ORFV廣泛分布于全球養羊地區，且發生頻率在世界范圍內逐年上升。近年來，在我國黑龍江、河南、福建等地均有ORFV引發疾病的報道[13-15]。ORFV基因組較大，大多數基因的功能還未闡明。Friebe等[11]預測了ORFV 023基因可能編碼囊膜蛋白，但未對該基因的結構和功能進行更深一步的研究。鑒于此，為了探索023基因的結構與功能，本試驗首先通過原核表達獲取023蛋白，同時結合生物信息學方法分析該蛋白分子特性。研究中所采用的生物信息學方法參照了王光祥等[16]的研究，同時制備了ORFV 023蛋白和鼠源多克隆抗體等珍貴的生物材料，為下一步深入研究該蛋白的結構與功能奠定了基礎。

本研究采用PCR技術克隆ORFV 023基因，在大腸埃希菌中誘導表達融合蛋白。分析該蛋白的理化性質和疏水性發現該蛋白為親水穩定蛋白，但SDS-PAGE檢測發現融合蛋白既有少量存在于上清中，同時又主要以包涵體的形式存在于沉淀內，包涵體的形成不僅與外界因素有關，同時與蛋白內部是否存在信號肽等結構也有較大關系，有文獻報道信號肽結構有利于提高蛋白質的可溶性[17]，無信號肽結構的蛋白可能因可溶性較低而更易形成包涵體，生物信息學分析顯示ORFV 023蛋白無信號肽結構，從側面證明實驗結果與預測結果相符。Western-blot結果顯示，該蛋白能與鼠源抗ORFV血清發生特異性免疫反應，表明ORFV 023蛋白具有良好的特異性和抗原性。生物信息學分析結果顯示，ORFV 023蛋白大小約42 ku，與SDS-PAGE結果相符，不存在跨膜結構域，有30個磷酸化位點，二級結構內無規則卷曲及α-螺旋結構較多，β-折疊較少。β-折疊和無規則卷曲區域的二級結構比較松散，穩定性差，更易于盤旋和扭曲，容易與抗體分子結合，因此該區域可能存在優勢抗原表位。結合二級結構、親水性、柔韌性、抗原性、表面可及性等參數預測該蛋白B細胞抗原表位，有效避免了因參數過少而導致結果誤差較大，結果顯示在第26～28、84～87、144～146、246～254位可能存在優勢抗原表位。CTL表位是能與MHC-Ⅰ類分子結合從而誘導相應的CTL發生免疫應答的一類由8～10個連續氨基酸構成的短肽，其本質是抗原呈遞細胞處理遞呈的一種蛋白，能夠活化并決定CTL的特異性殺傷能力[18]。利用nHLAPred的ComPred在線服務器預測CTL表位，結果顯示在第154～162、230～234、237～242位可能存在CTL優勢表位。Th細胞表位是識別加工后的外源蛋白與MHC-Ⅱ類分子結合的一類抗原表位，能夠幫助激活Th細胞并刺激其釋放細胞因子參與細胞免疫，同時幫助B細胞產生特異性抗體[16]。利用ProPred在線服務器分別預測DRB1-0101、DRB1-0102、DRB1-0301三種不同的Th表位，結果顯示在第74～76、128～135、237～244位可能存在Th優勢表位。

表3羊口瘡病毒AH-F 10株023蛋白的Th細胞表位預測

Table3Th cell epitope prediction of ORFV AH-F10 strain 023 protein

DRB1-0101順序Rank起始位置Start position序列SequenceDRB1-0102順序Rank起始位置Start position序列SequenceDRB1-0103順序Rank起始位置Start position序列Sequence144WIPETALWS136IYNNYAYGW140YAYGWIPET258YRVTDFYPI268LGMLKKFEF268LGMLKKFEF374FEFMFSLLA374FEFMFSLLA376FMFSLLADP4127FLLLSSVPI4127FLLLSSVPI480LLADPGGAC5136FNILFWFKG5136FNILFWFKG5127FLLLSSVPI6178YKPLFSRLG6207IGRLPPSDF6138ILFWFKGET7207IGRLPPSDF7233VLCFLVFYV7141WFKGETFDT8227YTRYDPVLC8236FLVFYVPGL8207IGRLPPSDF9236FLVFYVPGL9237LVFYVPGLS9218LANLSTILY10238VFYVPGLSA10238VFYVPGLSA10224ILYYTRYDP11240YVPGLSATT11233VLCFLVFYV12236FLVFYVPGL13237LVFYVPGLS14238VFYVPGLSA15240YVPGLSATT

本研究首次通過生物信息學方法對ORFV 023蛋白進行生物信息學分析，初步預測023蛋白的結構和功能、潛在的B細胞抗原表位，HLA抗原肽和MHC抗原肽，這為該蛋白的深入研究以及后期建立快速準確的診斷方法奠定了理論基礎。