中孕期母血清甲胎蛋白異質體L2和L3篩查胎兒唐氏綜合征的臨床價值

陳益明 盧莎 連結靜 梅瑾 顧琳媛 張艷珍 張聞 褚雪蓮 王昊 王敏

唐氏綜合征（Down’s syndrome，DS）又稱 21-三體綜合征、先天愚型，是新生兒出生缺陷常見的一類遺傳性疾病，是第21號染色體比正常人多出一條而導致以智力發育障礙為主要特征的綜合征[1-2]。產前篩查是指通過簡便、經濟和較少創傷的檢測方法，從母體血清中篩查胎兒患DS的風險性[3]，目前多采用中孕期母血清中甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、游離人絨毛膜促性腺激素β亞基（freeβsubunitofhumanchorionicgonadotropin，free β-HCG）、游離雌三醇（unconjugated Estradiol，uE3）等標志物進行篩查[4-5]。AFP 作為 DS 產前篩查中主要標志物之一已經在各地常規開展，但檢測靈敏度均較低[6]。血清中AFP與小扁豆素（lensculinaris agglutinin，LCA）結合后，經電泳分成三帶，依次命名為 AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3，即 LCA 非結合型（AFP-L1、AFP-L2）和 LCA 結合型（AFP-L3）[7]。通常把與LCA結合的不同構型的AFP稱為AFP異質體，它是新一代的腫瘤標志物[8]。有研究表明AFP-L2或AFP-L3在篩查DS方面優于AFP[9-10]，但有關AFP-L2和AFPL3聯合篩查DS方面的報道較少，因此，筆者選擇61例健康胎兒孕婦和88例產前診斷為DS胎兒的孕婦作為研究對象，探討母血清AFP-L2和AFP-L3水平與DS胎兒之間的關系及聯合篩查的效能情況，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 回顧2007年10月至2016年9月來自杭州市婦產科醫院（杭州市婦幼保健院）366 355例和杭州市余杭區婦幼保健院96 943例共2家產前篩查中心產前門診、妊娠15～20+6周的單胎孕婦463 298例。根據孕婦妊娠結局有無胎兒DS將研究對象分為病例組和對照組，病例組為經羊水細胞染色體核型分析確診為DS胎兒的孕婦88例，對照組為隨機抽取同時期胎兒發育正常的孕婦61例。兩組孕婦的年齡、孕期及體重比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 兩組孕婦一般資料的比較

1.2 診斷和排除標準 病例診斷依據中國出生缺陷監測網制訂的診斷標準[11-12]，其主要特征如下：（1）眼距寬（＞2.5cm）；（2）塌鼻；（3）外眥上斜；（4）全身肌張力低；（5）雙側或單側通貫手和（或）高位三叉點t；（6）小指短小，其中節短或缺如；（7）Ⅰ、Ⅱ趾距寬（草鞋足）；（8）拇趾球部脛側弓狀紋；（9）低位耳。以上特征中有5項組合再結合其他特點可初步篩查為DS，確診需作染色體檢查。染色體分析：以核型47，XX（或XY）+21最常見，占94%～95%；1%～2%為 21-三體嵌合型；2%～3%為易位型，包括D/G易位和G/G易位。排除標準：（1）雙胎、多胎妊娠；（2）合并其他內科疾病如胰島素依賴性糖尿病及嚴重妊娠并發癥；（3）吸煙；（4）試管嬰兒；（5）隨訪結果為18-三體、13-三體、神經管缺陷以及其他出生缺陷；（6）資料信息不全者；（7）孕婦信息與血清標本不匹配者。

1.3 方法

1.3.1 試劑和儀器 2家篩查中心統一使用1235 Auto DELFIA自動時間分辨熒光免疫分析儀（美國Perkin Elmer公司）進行產前篩查檢測，配套雙標記試劑盒（AFP/free β-HCG）、增強液、洗液、質標品和標準品（美國Perkin Elmer公司）；采用 RT-6100酶標儀（美國Rayto公司），988洗板機（北京 Tianshi公司），AFP-L2（美國BIM公司）和AFP-L3試劑（美國BIM公司）。

1.3.2 檢測方法 抽取空腹外周靜脈血2～3ml，30min后分離血清標本并保存于2～8℃冰箱，于1周內送檢，產前篩查指標為AFP和free β-HCG。產前篩查檢測結束后多余血清標本儲存于-80℃冰箱保存。累積到一定數量后集中檢測AFP-L2和AFP-L3水平，檢測前將病例組和對照組的信息資料與儲存的血清標本進行匹配，并將血清標本進行低溫離心混勻和批量檢測，應用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）分別檢測AFP-L2和AFP-L3水平。

1.4 妊娠結局隨訪 每例篩查對象均在新生兒出生前后進行三級網絡隨訪，對孕期發生自然流產、死胎或死產的胎兒進行相關檢查以確診，并對新生兒進行常規體格檢查。按照《中國出生缺陷監測方案》填報《出生缺陷兒登記卡》，出生缺陷診斷按國際疾病分類標準（ICD-10）進行分類診斷。

1.5 風險估計 DS的風險值通過將DS的年齡風險值與對應正態分布似然比值相乘計算[13]，年齡風險值計算方程取自Cuckle等[14]研究結果。建立不同模型對DS篩查效能進行比較，通過AFP-L2、AFP-L3多指標以建立模型形式對DS篩查效能比較分析，使用AFP-L2、AFPL3構建的風險計算模型相比于原單獨使用AFP MoM值作為單截斷的方式有更好的篩查效能。AFP-L2、AFP-L3的MoM值服從多元正態分布f（AFP-L2 MoM，AFP-L3 MoM），按照風險計算模型的建模方法，可以計算得出各指標分布的對應參數，模型通過計算分布似然比作為DS風險[13]。使用相同的原理分別構建四個模型：模型一：AFP+free β-HCG；模型二：AFP-L2+free β-HCG；模型三：AFP-L3+free β-HCG；模型四：AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG。

1.6 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件，正態性檢驗采用One-sample Kolmogorov-Smirnov檢驗，正態分布的計量資料以 表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。ROC曲線與最佳切值計算[15]，并計算AFP-L2和AFP-L3的最佳臨界值、AUC、靈敏度、特異度、約登指數。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組孕婦血清AFP-L2、AFP-L3水平比較 DS組孕婦血清AFP-L2高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；DS組孕婦血清AFP-L3高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），見表 2。

表2 兩組孕婦血清AFP-L2、AFP-L3水平比較

2.2 AFP-L2和AFP-L3單獨篩查DS胎兒的價值 AFPL2 篩查 DS 胎兒的 AUC=0.891（95%CI∶0.841～0.941），P＜0.01。根據ROC曲線計算出AFP-L2篩查DS胎兒的最佳臨界值為6.24 ng/ml，其靈敏度、特異度、約登指數分別為：0.721、1.000、0.721；AFP-L3 篩查 DS 胎兒的AUC=0.824（95%CI：0.756～0.891），P＜0.01。AFP-L3 篩查DS胎兒的最佳臨界值為1.75ng/ml，其靈敏度、特異度、約登指數分別為：0.663、0.967、0.627。見圖 1。

2.3 AFP-L2和AFP-L3聯合篩查DS胎兒的效能 不同建模方式結果比較，以AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG篩查 DS 胎兒的 AUC 最高=0.929（95%CI：0.861～0.975），P＜0.01。最佳臨界值為1/1 636時，此時的靈敏度、特異度、約登指數分別為：0.907、0.857、0.764，不同建模 AUC的高低順序是以AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG＞AFPL2+free β-HCG＞AFP-L3+free β-HCG＞AFP+free β-HCG，見表3和圖2。

圖1 AFP-L2、AFP-L3等單項指標篩查DS的ROC曲線

表3 AFP、AFP-L2、AFP-L3單獨篩查和聯合篩查DS效能分析

3 討論

目前DS產前篩查方法，一般是采用AFP+free β-HCG二聯法篩查或AFP+free β-HCG+uE3三聯法篩查，這些篩查方法的靈敏度只有 60%～70%[3-4，6]，為提高DS篩查的靈敏度，臨床上不斷在尋找新的DS篩查標志物，有研究表明AFP-L2或AFP-L3篩查DS方面優于傳統的AFP篩查[9-10，16-17]，但尚未見有關AFP-L2和AFP-L3聯合free β-HCG篩查DS方面的報道，因此，本研究選擇61例健康胎兒孕婦和88例產前診斷為DS胎兒的孕婦作為研究對象，以探討母血清AFP-L2和AFP-L3與DS胎兒的相關性，并比較AFP-L2和AFPL3代替AFP后，聯合free β-HCG并建立不同建模聯合DS篩查效能情況。

圖2 AFP-L2、AFP-L3等多項指標聯合篩查DS的ROC曲線

本研究結果顯示，DS胎兒的孕婦血清AFP-L2、AFP-L3水平均高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。俞菁等[10]研究結果表明DS孕婦血清AFPL2%高于健康孕婦，差異有統計學意義（P＜0.05）。龍峰等[18]研究結果示DS孕婦血清中AFP-L3%高于正常孕婦，差異有統計學意義（P＜0.05），上述研究結果與本研究結果一致，但Huai等[19]研究結果表明孕有DS胎兒孕婦血清AFP-L3中位數為0.46，顯著低于1在正常對照組（P＜0.05），與本研究結果不同，可能與采用AFP-L3評價方式不同有關。

本研究AFP-L2篩查DS胎兒的AUC=0.891（95%CI：0.841～0.941），P＜0.01。AFP-L3 篩查 DS 胎兒 AUC=0.824（95%CI：0.756～0.891），P＜0.01。遠高于 AFP 的AUC=0.509（95%CI：0.414～0.603）。龍峰等[18]AFP-L3%的AUC=0.710，結果顯示以AFP-L3%≥10%為界限時，可以很好地區分DS孕婦和正常孕婦。Yamamoto等[9]AFP、AFP-L3%、AFP-L3和 AFP-L3/AFP的 AUC=0.750、0.868、0.949和0.946。AFP-L3和AFP-L3/AFP的AUC顯著高于 AFP-L3%（P＜0.05）和 AFP（P＜0.05），與本研究結果相近。根據ROC曲線計算出AFP-L2、AFP-L3篩查DS胎兒的最佳臨界值分別為：6.24ng/ml、1.75ng/ml時，其靈敏度、特異度、約登指數分別為：0.721、1.000、0.721；0.663、0.967、0.627。均高于 AFP 的 0.525、0.558、0.083。

Huai等[19]研究結果表明使用1/270為臨界值時，如果AFP-L3替代 AFP對三聯篩查（AFP、HCG、uE3）檢測的靈敏度從74%提高到81%，假陽性率從5.4%到6.8%略有增加。同樣，如果采用四聯篩查（AFP、HCG、uE3，抑制素A）檢測，AFP-L3取代AFP后，其靈敏度從81%提高到89%，假陽性率從4.6%到5.6%略有增加。在中孕期DS篩查中AFP-L3替代AFP在稍高的假陽性率為代價時，具有更高的靈敏度。Yamamoto等[20]研究結果表明母體血清中AFP-L3%能有效區分是否孕有DS患兒。在假陽性率5%時，孕婦血清AFP-L3%可發現55%的DS患兒。在產前DS篩查上AFP-L3可以有效替代AFP。本研究也是以AFP-L2、AFP-L3替代AFP并與free β-HCG建立不同模型分析后結果顯示，以AFPL2+AFP-L3+free β-HCG篩查DS胎兒的AUC最高=0.929（95%CI：0.861～0.975）。最佳臨界值為 1/1 636 時靈敏度、特異度、約登指數分別為：0.907、0.857、0.764，不同模型聯合篩查DS的效能高低順序是以AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG＞AFP-L2+free β-HCG＞AFPL3+free β-HCG＞AFP+free β-HCG。

目前AFP-L2、AFP-L3作為科研試劑成本為每人次100元左右，相比傳統AFP試劑成本略高，如果以后能推廣為常規檢測，則試劑成本應該與AFP相近。

綜上所述，中孕期母血清AFP-L2和AFP-L3篩查DS胎兒具有較高的靈敏度和特異度，可替代AFP篩查DS，并以AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG聯合篩查效能最高。