甲狀腺乳頭狀癌中FMNL2和EMT相關蛋白的表達及其臨床意義

曹學全 章輝 盧洪勝 戴岳楚 魏科娜 楊朝暉 范廣民 顧華敏

甲狀腺癌是內分泌系統最常見的惡性腫瘤，在過去幾十年中其發病率已經增加了3倍，超過四分之三是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1-2]。PTC的發病機制尚不完全清楚，研究與PTC發生、發展有關的基因具有重要意義。上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是惡性腫瘤發生浸潤轉移的細胞學基礎，在EMT過程中，腫瘤細胞表現為上皮標志物如E-鈣粘素等表達下降，細胞黏附減弱，間質標志物如波形蛋白等表達增加[3]。同源形成素樣蛋白2（forminlike protein 2，FMNL2）是近年來發現與轉移相關的一種新基因，屬于形成素同源蛋白家族成員之一。FMNL2可作為Rho家族鳥苷三磷酸酶的效應分子，并在致癌中發揮重要作用。FMNL2在肺癌、惡性黑色素瘤等多種惡性腫瘤中表達增加，并且與侵襲、轉移呈正相關[4-6]。關于PTC組織中FMNL2表達的臨床意義及與EMT相關蛋白關系的研究鮮見文獻報道，本研究采用免疫組化En Vision法檢測FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白在PTC和相應癌旁組織中的表達差異，分析FMNL2和EMT相關蛋白的關系及對PTC發生、發展的可能作用機制，為PTC的分子靶向治療提供新思路。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年1月至2018年1月我院住院行手術切除PTC標本80例，術后均經病理檢查證實為PTC。所有患者術前均未接受放療、化療及生物學治療。80例PTC患者中，男26例，女54例；年齡21～77（45.37±12.04）歲，其中＜45歲42例，≥45歲38例。腫瘤直徑≤2cm 56例，＞2cm 24例；伴有包膜侵犯28例，無包膜侵犯52例；伴有淋巴結轉移47例，無淋巴結轉移33例；參照2010年第7版美國癌癥聯合委員會（AJCC）/國際抗癌聯合會（UICC）制定的甲狀腺癌分期標準進行TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期27例。同時選取其中30例患者距離腫瘤2cm的相應癌旁組織（經病理檢查為正常甲狀腺組織）作為對照組。

1.2 主要試劑 FMNL2兔抗人多克隆抗體購自英國Abcam公司，E-鈣粘素和波形蛋白鼠抗人單克隆抗體購自福州邁新生物技術有限公司，EnVision通用試劑盒及二氨基聯苯胺（DAB）均購自廣州基因公司。

1.3 免疫組化方法 應用免疫組化En Vision法檢測FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白的表達。嚴格按照試劑盒說明書操作，石蠟切片常規脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育10min，0.1mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液微波修復，3%BSA封閉30min，分別滴加一抗（FMNL2抗體濃度為1∶200，E-鈣粘素和波形蛋白均為1∶100）4℃過夜，滴加二抗（En Vision免疫組化檢測試劑），DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸分化、乙醇及二甲苯脫水和樹膠封固，顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性組織作陽性對照。

1.4 結果判定 以細胞質或細胞膜出現淡黃色或棕黃色顆粒為陽性，FMNL2和波形蛋白均定位于細胞質，E-鈣粘素定位于細胞質或細胞膜。在光學顯微鏡下，每張切片隨機選取至少5個高倍視野（×400），觀察并記錄每張切片的染色強度和面積，通過半定量積分法進行判定。染色強度：無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞數的百分比：陽性細胞數百分比≤5%為 0分；6%～10%為1分；11%～20%為 2分；21%～50%為 3分；＞50%為4分。細胞染色強度與陽性細胞百分比計分的乘積為每例的最終積分。＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計數資料組間比較采用χ2檢驗，PTC中FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白之間表達的相關性采用Spearman等級相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTC和癌旁組織中FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白的表達 FMNL2、波形蛋白在PTC組織中陽性表達率分別為 61.25%（49/80）和 76.25%（61/80），癌旁組織分別為 13.33%（4/30）和 20.00%（6/30），差異均有統計學意義（χ2=20.064、28.994，均P＜0.05）；而 E-鈣粘素在PTC組織中的陽性表達率為32.50%（26/80），顯著低于癌旁組織的80.00%（24/30），差異有統計學意義（χ2=19.855，P＜0.05）。見圖 1（見插頁）。

2.2 PTC組織中FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白表達與臨床病理特征的關系 FMNL2、波形蛋白表達在包膜有無侵犯、淋巴結是否轉移及不同臨床分期者間的差異均有統計學意義（均P＜0.05），而在不同年齡、性別和腫瘤直徑者中的差異均無統計學意義（均P＞0.05）；E-鈣粘素在包膜侵犯、淋巴結轉移及Ⅲ～Ⅳ期PTC者中陽性表達率低，在無包膜侵犯、無淋巴結轉移及Ⅰ～Ⅱ期PTC者中陽性表達率高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），而在不同年齡、性別和腫瘤直徑者中的表達差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 PTC組織中FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白的表達與臨床病理特征的關系

2.3 PTC原發灶和淋巴結轉移灶中FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白的表達情況 47例原發灶組織中FMNL2陽性表達率為76.60%（36/47），對應淋巴結轉移灶組織中的陽性表達率為100.00%（47/47），淋巴結轉移灶中FMNL2 表達明顯高于原發灶（χ2=9.553，P＜0.05）；淋巴結轉移灶組織中波形蛋白陽性表達率為100.00%（47/47），高于原發灶的91.49%（43/47），差異有統計學意義（χ2=4.178，P＜0.05）；淋巴結轉移灶組織中E-鈣粘素陽性表達率為4.25%（2/47），低于原發灶的17.02%（8/47），差異有統計學意義（χ2=4.028，P＜0.05）。

2.4 PTC組織中FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白表達的相關性 PTC組織中FMNL2、波形蛋白表達與E-鈣粘素表達均呈負相關（r=-0.325、-0.554，均P＜0.05），FMNL2表達與波形蛋白表達呈正相關（r=0.340，P＜0.05）。見表 2、3。

3 討論

據報道，EMT和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是造成腫瘤細胞侵襲和轉移的原因[7]。EMT在胚胎發育過程中是一種從上皮細胞向間充質細胞表型轉化的重要表型，與腫瘤的侵襲和轉移密切相關[8]。EMT的特征是上調間充質細胞特異性標記蛋白，包括N-鈣黏著蛋白和波形蛋白，以及下調上皮細胞特異性標記蛋白，如E-鈣粘素，MMPs和細胞外基質蛋白分泌增多，基底膜和細胞外基質被破壞，從而細胞獲得運動遷移能力[9]。本研究結果顯示，PTC組織中波形蛋白陽性表達顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），而E-鈣粘素在PTC組織中表達下調，明顯低于癌旁正常組織（P＜0.05），提示EMT相關蛋白（波形蛋白和E-鈣粘素）異常表達可能在PTC發生過程中起作用。進一步研究發現，波形蛋白在PTC包膜侵犯、淋巴結轉移、Ⅲ～Ⅳ期及淋巴結轉移灶組織中陽性表達率高，而在PTC無包膜侵犯、無淋巴結轉移、Ⅰ～Ⅱ期及原發灶組織中陽性表達率低，差異有統計學意義，而E-鈣粘素表達情況則相反，表明EMT相關蛋白表達狀態改變可能參與PTC的局部浸潤、淋巴結轉移及臨床進展的過程。

表2 PTC組織中FMNL2、波形蛋白表達與E-鈣粘素表達的相關性

表3 PTC組織中FMNL2、波形蛋白表達的相關性

FMNL2編碼蛋白質是進化上保守formin家族的蛋白質成員，這些蛋白質是細胞骨架的調節劑。FMNL2具有影響肌動蛋白聚合和肌動蛋白絲形成的結構域，是建立在遷移和侵襲過程中調節細胞邊緣突起的肌動蛋白聚集因子[10-11]。在生理和病理情況下，FMNL2在細胞生長過程中發揮關鍵作用，如絲狀體形成、細胞遷移、胞質分裂、細胞黏附、細胞極性和腫瘤進展等[12]。有文獻報道，FMNL2具有Rho家族鳥苷三磷酸酶結構域，細胞運動時可形成偽足，在結直腸癌細胞侵襲轉移過程中起重要作用[13]。熒光定量聚合酶鏈反應結果證實，FMNL2 mRNA水平在舌鱗狀細胞癌中顯著升高，且其高表達與淋巴結轉移和晚期腫瘤密切相關，表明FMNL2作為轉移的正調控因子。多因素分析顯示FMNL2表達具有獨立的預后意義[14]。本研究采用免疫組化En Vision法檢測PTC和相應癌旁正常組織中FMNL2的表達情況，結果顯示，PTC組織中FMNL2蛋白陽性表達率明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05），并且PTC隨著包膜侵犯、淋巴結發生轉移及臨床分期增加，FMNL2蛋白陽性表達率進一步升高（P＜0.05），表明FMNL2表達升高可能與PTC的發生、侵襲和轉移有關，本研究結果與上述文獻報道一致。為了進一步顯示FMNL2在PTC轉移中的作用，本研究檢測了原發灶和對應淋巴結轉移灶中FMNL2的表達差異，發現淋巴結轉移灶組織中FMNL2表達明顯高于原發灶（P＜0.05），提示FMNL2表達升高可能會導致原發灶的一些癌細胞容易發生轉移。

Li等[15]發現，FMNL2通過Smad3效應分子或者MAPK/MEK信號通路參與TGF-β誘導的EMT，進而促進結直腸癌細胞侵襲和轉移。本研究還分析FMNL2與EMT相關蛋白的相關性，發現FMNL2、波形蛋白表達與E-鈣粘素表達均呈負相關，FMNL2表達與波形蛋白表達呈正相關，提示在PTC組織中，FMNL2表達與EMT相關蛋白表達密切相關，FMNL2過表達可能與EMT的發生有關。綜合上述研究結果，FMNL2和EMT相關蛋白異常表達可能聯合參與PTC的發生、惡性進展過程，為PTC的靶向治療和預后判斷提供新思路。