英紅九號紅茶生化成分指紋圖譜初探

凌彩金，范杰文，王秋霜，周巧儀，劉淑媚

（1.廣東省農業科學院茶葉研究所/廣東省茶樹資源創新利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2. 華南師范大學化學與環境學院，廣東 廣州 510006）

英紅九號是從云南大葉有性群體品種中單株分離，經30多年系統選育而成的無性系大葉紅茶品種［1］。以英紅九號為原料加工而成的英德紅茶，可與世界上著名的印度紅茶、斯里蘭卡紅茶媲美，被茶界譽為后起之秀，同時與國內的滇紅、祁紅被認定為中國三大著名出口紅茶［2］。目前，英紅九號紅茶的品質審評主要采用感官審評，即在一定的環境、設備條件下，茶葉評審人按茶葉色澤、香氣、滋味、性狀、葉底分別進行評價，以確定茶葉的品質和等級。但是通過感官審評對英紅九號紅茶的品質進行評定，其結果受審評環境、設備及審評員工作經驗等多種不穩定因素的影響。

目前，國內外對茶葉指紋圖譜的研究主要采用高效液相色譜法（HPLC）［3］，以茶葉各色譜峰的峰面積為因子，運用相關系數、聚類分析等方法構建茶葉HPLC指紋圖譜［4-5］。有研究報道，通過構建綠茶指紋圖譜可用于預測綠茶的抗氧化能力［6］。但在茶葉生化成分、微量元素等常規理化指標方面而構建的指紋圖譜研究較少。本研究采用國家茶葉標準中的方法測定春、夏、秋三季英紅九號紅茶常規生化成分的含量，分析不同季節各生化成分的差異，構建數字化的英紅九號紅茶生化成分指紋圖譜，為英紅九號紅茶的常規生化成分指紋圖譜的構建提供參考，在區分英紅九號與其他品種紅茶，對不同季節英紅九號紅茶進行分類提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

春、夏、秋三季英紅九號紅茶樣本由廣東省農業科學院茶葉研究所提供，共23個樣品；另有來自其他企業的6個紅茶茶樣作為對照樣品（表1）。茶葉采摘標準為一芽二葉，茶樣采摘、加工處理后密封貯存，貯存條件按GB/T 30375-2013 執行［7］。

試劑：磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、堿式醋酸鉛、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、硫酸、鹽酸、茚三酮、氯化亞錫、蒽酮，均為分析純；試驗用水為蒸餾水。

儀器：AE200型分析天平（上海梅特勒-托利多公司）、HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）、PHS-3C型pH計（上海雷磁儀器廠）、725N型紫外分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）、ML-50 型快速水分測定儀（日本AND公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶樣準備 稱取經粉碎過孔徑0.250 mm篩的樣品1.000 g（精確至0.001 g），放入250 mL錐形瓶中，加入90 mL沸水，浸提45 min，每隔10 min振蕩1次。浸提完畢后，趁熱過濾，待茶湯冷卻至室溫后加水定容至100 mL，備用。

表1 樣品信息

1.2.2 理化指標測定 水分含量測定采用快速水分測定儀進行測定；茶多酚含量測定采用福林酚法，按GB/T 8313-2008執行［8］；游離氨基酸總量測定采用茚三酮比色法，按GB/T8314-2013執行［9］；咖啡堿含量測定采用紫外分光光度法，按GB/T8312-2013執行［10］；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法［11］；水浸出物含量測定采用全量法，按GB/T8305-2013執行［12］。

試驗數據采用Microsoft Excel 2007軟件處理，用SPSS19.0軟件進行方差分析和顯著性檢驗。

1.3 生化成分指紋圖譜的構建與分析

通過對不同品種、不同季節紅茶中各生化成分含量進行分析，檢驗不同品種、不同季節間的生化成分含量差異。然后以茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖及水浸出物5種生化成分含量為變量，運用SAS 9.4軟件中的系統聚類分析（離差平方和法）對29個茶樣進行聚類，以構建聚類數字化的英紅九號紅茶生化成分指紋圖譜，并對圖譜進行分析。

具體步驟如下：（1）用標準差標準化方法，對茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、水浸出物等5項指標的原始數據進行處理；（2）計算樣品的離差平方和；（3）采用WARD法得到樣品間的平方距離，依據不同的聚類標準（半偏R2），對各樣本進行聚類，并作出聚類譜系圖。

2 結果與分析

2.1 生化成分含量

采用國家茶葉標準方法測定了春、夏、秋三季英紅九號紅茶與對比茶樣的常規生化成分含量，結果見表2；對春、夏、秋三季英紅九號紅茶的水分、茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、水浸出物含量進行差異性分析，結果見表3。另外，對英紅九號春茶、云南滇紅春茶及凌云白毫春茶3個紅茶品種的各種生化成分含量進行差異性分析，結果見表4。

表2 春、夏、秋三季英紅九號紅茶與對比茶樣的生化成分含量（%）

表3 英紅九號紅茶不同季節間各生化成分含量差異性分析

表4 不同品種紅茶生化成分含量差異性分析

2.1.1 茶多酚 從表2可以看出，英紅九號紅茶的茶多酚含量為14.15%，其中夏季英紅九號的茶多酚含量最高、為17.31%，春季的茶多酚含量最低、為13.40%，英紅九號紅茶的茶多酚含量在不同季節中總體表現為夏季＞秋季＞春季（表2）。已有研究表明，在其他因素較一致的情況下，氣溫、日照影響著鮮葉中生化成分的含量變化［13］，而茶多酚的基本規律為溫度和光照有利于茶多酚物質的積累［14］。

采用SPSS19.0軟件對英紅九號春、夏、秋三季紅茶的茶多酚含量進行差異性分析，結果（表3）顯示，英紅九號紅茶不同季節間茶多酚含量差異極顯著。對英紅九號春茶、云南滇紅春茶及凌云白毫春茶3個紅茶品種進行差異性分析，結果（表4）顯示，不同品種紅茶間茶多酚含量差異顯著。

2.1.2 氨基酸 不同季節的英紅九號紅茶的氨基酸含量為4.00%，其中夏季英紅九號的氨基酸含量最高、均值為4.13%，春季的氨基酸含量最低、均值為3.85%，英紅九號紅茶的氨基酸含量在不同季節中總體表現為夏季＞秋季＞春季（表2）。氨基酸是重要的滋味物質［15］，其含量則茶葉滋味鮮醇、香氣也好［16］。一般來說，春茶氨基酸含量高于夏秋茶，春茶的滋味也因此更鮮爽、香氣更加濃烈。本研究中，春季英紅九號紅茶的氨基酸含量略低于夏秋季，可能因種植過程中受氣溫、雨量等氣候因素的影響所致。

對英紅九號春、夏、秋三季紅茶的氨基酸含量進行差異性分析，結果（表3）顯示，英紅九號紅茶不同季節間氨基酸含量無顯著性差異。對英紅九號春茶、云南滇紅春茶、凌云白毫春茶等3個紅茶品種進行差異性分析，結果（表4）顯示，不同品種紅茶間氨基酸含量差異極顯著。

2.1.3 咖啡堿 不同季節的英紅九號紅茶的咖啡堿含量為3.20%，其中夏季英紅九號的咖啡堿含量最高、均值為3.79%，秋季的咖啡堿含量最低、均值為3.05%，英紅九號紅茶的咖啡堿含量在不同季節中總體表現為夏季＞春季＞秋季（表2）。茶葉中的咖啡堿含量與茶樹的生長條件、品種、產地、加工方法和采收期等諸多因素相關，一般規律是遮光條件下栽培的茶樹咖啡堿含量較高，細嫩茶葉比粗老茶葉含量高，夏茶比春茶含量高［17］，本研究結果與此規律相符。

對英紅九號春、夏、秋三季紅茶的咖啡堿含量進行差異性分析，結果（表3）顯示，英紅九號紅茶不同季節間咖啡堿含量差異極顯著。對英紅九號春茶、云南滇紅春茶、凌云白毫春茶等3個紅茶品種進行差異性分析，結果（表4）顯示，不同品種紅茶間咖啡堿含量無顯著差異。

2.1.4 可溶性糖 不同季節的英紅九號紅茶的可溶性糖含量為3.19%，其中春季英紅九號的可溶性糖含量最高、均值為3.70%，夏季的可溶性糖含量最低、均值為2.74%，英紅九號紅茶的可溶性糖含量在不同季節中總體表現為春季＞秋季＞夏季（表2）。可溶性糖是茶湯呈甜味的主要物質，可緩解茶多酚、咖啡堿造成的茶湯苦澀味。春季英紅九號的可溶性糖高于夏季及秋季，故英紅九號春茶的滋味更香甜［18］。

對英紅九號春、夏、秋三季紅茶的可溶性糖含量進行差異性分析，結果（表3）顯示，英紅九號紅茶不同季節間可溶性糖含量無顯著差異。對英紅九號春茶、云南滇紅春茶、凌云白毫春茶等3個紅茶品種進行差異性分析，結果（表4）顯示，不同品種紅茶間可溶性糖含量差異顯著。

2.1.5 水浸出物 不同季節的英紅九號紅茶的水浸出物含量為40.49%，其中夏季英紅九號的水浸出物含量最高、均值為42.36%，春季的水浸出物含量最低、均值為36.95%，英紅九號紅茶的水浸出物含量在不同季節中總體表現為夏季＞秋季＞春季（表2）。水浸出物的主要成分是茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、水溶色素、水溶性果膠、可溶性蛋白、維生素和無機鹽等［19-21］。

對英紅九號春、夏、秋三季紅茶的水浸出物含量進行差異性分析，結果（表3）顯示英紅九號紅茶不同季節間水浸出物含量差異顯著。對英紅九號春茶、云南滇紅春茶、凌云白毫春茶等3個紅茶品種進行差異性分析，結果（表4）顯示，不同品種紅茶間水浸出物含量無顯著性差異。

2.2 生化成分指紋圖譜的構建與分析

通過對不同品種、不同季節紅茶中茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖及水浸出物5種生化成分進行分析，結果顯示不同品種的生化成分含量存在差異，不同季節間的英紅九號的生化成分含量也存在差異。因此，本研究以這5種生化成分含量為變量，運用SAS 9.4軟件中的系統聚類分析（離差平方和法）對29個茶樣進行聚類，結果見圖 1。

結果顯示，在不同的聚類標準（半偏R2）下，聚類結果不同，當半偏R2為0時，每個樣品為單獨的一類；隨著半偏R2標準逐漸放大，29個區域單位被依次聚類。當半偏R2為0.25時，29個區域被聚為9類，其中夏季英紅九號紅茶1號和2號為一類，春季英紅九號19、20和22號為一類，秋季英紅九號9、10和12號為一類，秋季英紅九號4、5、13和15號為一類。聚類結果（圖1）表明，英九的春、夏、秋三季紅茶各生化成分含量存在差異。同時，當半偏R2為0.25時，凌云白毫紅茶28號和29號聚為一類，云南滇紅23、24、25和26號為一類，這說明在茶葉生化成分含量上，英紅九號紅茶、凌云白毫及云南滇紅有明顯區別。

圖1 29個茶葉樣品的系統聚類譜系

由此可見，茶葉中各生化成分含量可作為不同季節、不同品種紅茶聚類的依據。以各生化成分含量為變量的聚類分析能對不同季節的英紅九號紅茶進行歸類，也能準確地區分英紅九號紅茶與其他品種。

3 結論與討論

本試驗采用國家茶葉標準中的方法測定了不同季節英紅九號紅茶和其他品種紅茶的茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、水浸出物5種生化成分的含量。差異性分析發現，不同季節英紅九號紅茶的茶多酚、咖啡堿、水浸出物含量差異顯著；不同品種紅茶的茶多酚、氨基酸、可溶性糖含量差異顯著。以茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖和水浸出物含量為因子，用聚類分析的方法建立數字化英紅九號紅茶生化成分指紋圖譜，在區分英紅九號與其他品種紅茶、不同季節英紅九號紅茶進行歸類方面具有可行性。

茶樹作為一種多年生植物，其芽葉中所含的內質成分與成茶品質有著密切的關系。本試驗中，春、夏、秋三季的英紅九號紅茶的茶多酚、游離氨基酸和水浸出物含量隨著季節的不同而產生差異，總體表現均為夏季含量最高，春季含量最低；可溶性糖含量總體表現為春季最高，夏季最低；英紅九號3個季節中的茶多酚、咖啡堿及水浸出物含量存在明顯差異。不同季節英紅九號紅茶生化成分產生差異的原因在于茶樹因生長所處的季節不同，溫濕度、降水量、日照時間及強度等的差異會對其新梢所含生化成分產生一定的影響。不同品種間，英紅九號紅茶、云南滇紅及凌云白毫春茶的茶多酚、氨基酸及可溶性糖的含量存在顯著差異，說明不同品種間春茶的生化成分組成存在一定的差異，這與相關文獻報道的結果一致［22］。

在系統聚類分析中，當半偏R2為0.25時，能夠區分春、夏、秋三季英紅九號紅茶以及其他品種紅茶，茶樣中的茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖及水浸出物5種生化成分可作為作為不同季節英紅九號紅茶、不同品種紅茶聚類的依據。本實驗室曾采用HPLC法對英紅九號、云南滇紅及凌云白毫品種加工制造的紅茶產品進行分析測定，以各色譜峰的峰面積為引子，采用聚類分析方法構建了鑒定不同品種及不同季節英紅九號紅茶的HPLC指紋圖譜分析方法［4］。本試驗分析結果中，與前期通過高效液相色譜法得出的系統聚類譜系圖存在差異，分析原因是由于聚類依據的不同而產生的差異。本試驗是以茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖及水浸出物5種生化成分含量作為聚類依據，HPLC指紋圖譜中是以兒茶素類化合物（C、EC、CG、GC、EGC等）的色譜峰面積作為聚類依據。此外也有研究表明，采用不同的聚類方法，對于相同的數據可能有不同的劃分結果，劃分結果也會隨選擇距離的不同而存在差異［23］。本試驗采用的聚類標準（半偏R2）與HPLC指紋圖譜采用的聚類標準（歐氏距離）不同，這也有可能是造成聚類譜系圖差異的原因之一。但總體而言，通過不同數據的聚類分析，都可以得出不同季節的英紅九號紅茶在內質成分的含量上存在一定的差異，可應用于英紅九號紅茶指紋圖譜研究。