青花菜病程相關蛋白基因BoPR2的克隆與表達

金魏佳，何 佳，章燕如，范靈希，唐露靜，葉佳燕，鄭 穎，蔣 明

（臺州學院生命科學學院，浙江 臺州 318000）

青 花 菜（Brassica oleracea var. italica） 又名西蘭花、綠菜花和綠花椰菜等，為十字花科（Cruciferae）蕓薹屬1年生或2年生草本蔬菜，是甘藍的一個變種［1］。青花菜以花球為主要食用部位，營養價值高，富含礦質元素、碳水化合物、蛋白質、維生素及抗癌活性成分蘿卜硫素（Sulforaphane），是一種深受人們喜愛的保健蔬菜［2-5］。在我國，隨著青花菜種植面積的不斷擴大，病害的發生日趨嚴重，根腫病和菌核病已成為青花菜大田生產過程中的兩種常見病害，每年造成的產量損失十分巨大［5-6］。根腫病由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae）引起，而菌核病由核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）造成，兩種病害在其他蕓薹屬蔬菜中的發生也十分普遍，是世界性病害［7-8］。我國不是青花菜的原產地，種質資源十分匱乏，而抗病材料更為稀缺，通過挖掘抗病相關基因開展分子育種是解決種質短缺的重要途徑之一，也是解析植物-病原菌互作機理的基礎和開展抗病分子育種的重要前提［9-10］。

病程相關蛋白（pathogenesis-related protein，PR）是植物體內的一類重要蛋白，在病原菌或物理、化學因子的誘導下表達或積累，在植物抵御病害及適應不良環境方面發揮著重要作用［11-12］。根據氨基酸序列的相似性、酶活性或其他生物學特性，PR可分為17個家族，不同類型的PR具有不同的結構特點和功能［13］。其中PR2具有β-1，3-葡聚糖酶活性，其主要作用是水解β-1，3-葡聚糖，這種糖類物質是病原菌細胞壁的主要成分，因此，PR2的生成與積累能抑制病原菌的生長和增殖［14-15］。近年來，已從煙草（Nicotiana tabacum）、番茄（Lycopersicon esculentum） 和 水 稻（Oryza sativa）等植物中克隆到PR2基因，并明確了它們的序列特征和抗病功能［16-18］，但是，有關PR2在青花菜中的研究未見報道。本研究以青花菜為材料，在克隆BoPR2基因的基礎上，利用生物信息學手段分析序列特征，用實時定量PCR明確其在蕓薹根腫菌和核盤菌侵染下的表達模式，為開展基因功能鑒定和抗病機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試青花菜材料為Bo0112，栽植于人工氣候箱，在16 h光照/8 h黑暗的光周期下培養，兩葉一心期時用于病原菌的接種。核盤菌采自浙江臨海上盤青花菜基地，經純化后保存于臺州學院生命科學學院實驗室。核盤菌接種采用菌絲塊法，對照用同樣大小的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar, PDA）培養基塊，采集接種0、6、12、24、36、72 h的葉片，用于RNA的提取。蕓薹根腫菌采自溫嶺石橋頭青花菜基地，采用張小麗等［19］的方法接種，對照用等量的無菌水，采集接種0、5、10、15、20、25 d的根用于RNA的提取。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA和RNA的提取 基因組DNA的提取采用SDS法［20］，RNA的提取采用Trizol法［21］，經電泳鑒定后置于超低溫冰箱保存備用。cDNA的合成采用TaKaRa公司的試劑盒，按其提供的說明書進行操作。

1.2.2 青花菜BoPR2基因的克隆 用于基因克隆的上、下游引物分別為BoPR2UP：5'-ATGGTACGATTCAAACATAT-3'和BoPR2DN：5'-TTAGTTGAACTTGACACCATATTT-3'，由北京鼎國生物技術有限公司合成，用無菌ddH2O配制成20 μmol/L備用。分別以DNA和cDNA為模板進行PCR擴增，20 μL體系中加入以下試劑：10×PCR緩沖液2 μL，20 ng模板DNA或cDNA，0.5 μL 10 m mol/L的dNTPs，0.8 U的Taq DNA聚合酶，上、下游引物各0.1 μL，加ddH2O至終體積。PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s、51℃退火45 s、72℃延伸45 s，共32個循環。PCR擴增結束后，產物用1 %的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.3 PCR產物的回收、轉化和測序 用無菌刀片割取含目的條帶的膠塊，采用試劑盒法（上海碧云天生物技術研究所）回收DNA。取1.5 μL回收產物與p-GEM-Teasy載體（Promega），置于4℃連接，用熱激法導入Trans5α感受態細胞（北京全式金生物技術有限公司）。經涂布平板，挑取白色單菌落于37℃振蕩培養12 h。用菌液PCR鑒定陽性克隆，PCR程序同基因克隆，模板改為0.5 μL菌液，經電泳檢測后取3個陽性克隆測序。

1.2.4 序列分析 利用DNAMAN5.2.2、在線工具SMART（http://smart.embl.de）和Compute PI/Mw（http://web.expasy.org/compute）對 BoPR2基因序列及其編碼蛋白進行理化性質分析［22］。從NCBI數據庫中下載甘藍型油菜（B. Napus，登錄號：XP_013742178.1）、野甘藍（B. oleracea var. oleracea， 登 錄 號：XP_013636025.1）、白 菜（B. rapa subsp.chinensis， 登 錄 號：BAG68207.1）、蘿卜（Raphanus.sativus，登錄號：XP_018458775.1）、擬南芥（A. thaliana，登錄號：ANM63774.1）、玉山筷子芥（A. lyrata subsp.Lyrata，登錄號：EFH54399.1）、亞麻薺（Camelina sativa，登錄號：XP_010516340.1）和薺菜（Capsella rubella，登錄號：EOA24328.1）等8種十字花科植物的PR2序列。用Clustalx 1.81進行序列比對，再利用Mega 3.1構建進化樹，構建方法為鄰接法（Neighbor-Joining），經1 000次自舉檢驗［23］。

1.2.5 基因表達分析 根據測序結果，設計實時定量PCR引物，上、下游引物序列分別 為5'-AAGCAGTACAGCATCCCTCG -3'和5'-TGGGAACGTCGAGGATGAAC -3'。表達采用肌動蛋白基因作為內標，上、下游引物分別 為： 5'-ACGTGGACATCAGGAAGGAC-3'和5'-GAACCACCGATCCAGACACT-3'。PCR 反 應在Roche Light Cycler 96 PCR儀上進行，反應程序：50℃ 5 min，94℃ 30 s；94℃ 5 s、55℃ 15 s、72℃ 10 s，共40個循環。實驗重復3次，用公式2-ΔΔCt計算相對表達量。

2 結果與分析

2.1 BoPR2基因的特征

以BoPR2UP和BoPR2DN為引物，分別以青花菜葉片基因組DNA和cDNA進行PCR擴增，經測序后得到各自的序列。結果表明，BoPR2基因組全長為1 188 bp，包含1個內含子（96 bp），第1與第2外顯子的長度分別為130 bp和962 bp（圖1）。

圖1 BoPR2基因結構

2.2 BoPR2編碼蛋白的特征

BoPR2編碼351個氨基酸，經Compute pI/Mw tool在線工具預測，BoPR2的理論等電點為6.85，分子式為C1740H2663N467O520S15，分子量為38 925 u，不穩定指數為40.48，為不穩定蛋白；其總平均親水性系數為-0.304，BoPR2為親水性蛋白。序列中的天冬酰胺含量最高、達到8.8%，絲氨酸次之、為8.5%，而半胱氨酸最少、僅0.3%。通過NCBI的Blast程序分析發現該蛋白含有1個保守的Glyco hydro 17結構域，位于+34 ～ +350處（圖2）。

圖2 BoPR2基因的編碼區及推導的氨基酸序列

2.3 BoPR2與同源序列的比對

為研究BoPR2的進化地位，從NCBI數據庫下載8種十字花科及其近緣植物的PR序列，用Clustalx 1.81進行序列的多重比對。由圖3（彩插一）可知，9個PR2蛋白由338～365個氨基酸殘基組成，其中，野甘藍的序列最長、氨基酸殘基數365個，甘藍型油菜次之、為363個，玉山筷子芥的最短、338個。序列比對結果表明，9種植物PR2的相似性較高，僅個別氨基酸存在差異，說明十字花科植物的PR2在進化上十分保守。與BoPR2相比，野甘藍在+9、+10位有2個氨基酸殘基的插入，甘藍型油菜則在+41、+86、+170、+173、+238、+260、+324、+327位存在差異；薺菜與其他同源序列之間的差異較大，在 +1～+15、+152～+153、+173、+247、+317、+341～+343、+360位發生氨基酸殘基的缺失，在+131、+230、+231位發生氨基酸殘基的插入。

2.4 BoPR2的系統發育分析

利用Mega 3.1構建進化樹，構建方法為鄰接法。結果（圖4）表明，8個不同物種的PR2在進化樹上可分為5組。其中，青花菜與同為蕓薹屬的野甘藍、甘藍型油菜和白菜的遺傳距離最小，它們之間的親緣關系最近，在系統發育樹上聚于I組；同為擬南芥屬的擬南芥和玉山筷子芥PR2之間的遺傳距離最近，它們在進化樹上處于同一組（Ⅴ）；蘿卜、薺菜、亞麻薺均單獨成組，分別為II、III、IV組。

圖4 BoPR2及其同源序列的進化樹

2.5 BoPR2的表達分析

為研究病原菌脅迫對青花菜BoPR2表達的影響，采用實時定量PCR檢測表達水平。結果（圖5）表明，核盤菌不能誘導BoPR2的表達，在侵染0～72 h期間，表達量未見顯著變化（圖5A）；在蕓薹根腫菌的誘導下，BoPR2的表達量逐漸增加，在10 d時的相對表達量最大，約為對照的6倍，隨后逐漸降低，在15 d和20 d時的相對表達量分別為對照的3.60、3.22倍（圖5B）。

圖5 青花菜BoPR2基因的表達

3 結論與討論

植物PR2是一類重要的病程相關蛋白，在生長發育及抵御病原菌、昆蟲和非生物脅迫等方面起著重要作用［24-25］。PR蛋白可分為17類，其中PR1的功能未知，PR2編碼β-1,3-葡聚糖酶，PR3、PR4、PR8和PR11則編碼幾丁質酶［26］。已從多種植物中克隆到PR2基因，大豆（Glycine max）GmBG1基因編碼347個氨基酸，等電點為8.71［14］；海島棉（Gossypium barbadense）GbGLU基因的全長為1 086 bp，編碼361個氨基酸，分子量為 39.66 ku［27］；小麥（Triticum aestivum）TcLr19PR2基因的編碼區全長為1 005 bp，編碼334個氨基酸［28］。本研究從青花菜中克隆到1個PR2基因，定名為BoPR2。該基因的編碼區全長為1 092 bp，編碼351個氨基酸，BoPR2與野甘藍PR2的相似度最高，僅存在2個氨基酸殘基的差異，而與同屬的甘藍型油菜、青菜的序列差異稍大，在進化樹上處于相鄰的分枝，這與蕓薹屬植物的分類結果一致。BoPR2編碼區的大小與芥菜（B. juncea）PR2相仿，芥菜BjPR2的編碼區全長為1 020 bp，編碼339個氨基酸［29］。

在正常環境條件下，植物體內的PR2含量較少，活性很低，但經病原菌侵染后，PR2的積累量顯著增加，表明PR2與植物抵御病害有關［30］。大豆GmBG1基因的表達受腐霉菌（Pythium ultimum）誘導，在抗病材料中表達量呈先上升后下降的趨勢，在24 h時達到最大值［14］；海島棉GbGLU基因受黃萎病菌（Verticillium dahliae）的誘導，在接種48 h時表達量開始升高，96 h時達到最大值［27］；半定量RT-PCR結果表明，該基因受小麥葉銹菌（Puccinia triticina）的誘導，表達量在48 h達到最大值［28］。蕓薹根腫菌是活體寄生菌，可激活植物的水楊酸信號途徑，而核盤菌為腐生營養菌，它激活寄主的茉莉酸/乙烯信號途徑，而PR2是水楊酸信號途徑的一個標志基因［31］。本研究中，在蕓薹根腫菌的誘導下，青花菜BoPR2的表達量逐漸增加，在10 d時的相對表達量達到對照的6倍，但是，BoPR2基因的表達并不受核盤菌的誘導。在黑斑病菌（Alternaria brassicae）侵染下，芥菜BjPR2的表達量也呈先上升后下降的趨勢，在24 h時表達量達到最大值［29］。

本研究以青花菜為材料，克隆得到1個PR2基因，并明確了其序列特征和表達特點，該基因的表達受蕓薹根腫菌的誘導。下一步，將利用遺傳轉化方式研究該BoPR2在抗病反應中的功能。