響應面法優化超聲提取芝麻粕中多酚工藝及其抗氧化活性研究

張海容，陳金娥，高瑞苑

(忻州師范學院 生化分析技術研究所，山西 忻州 034000

芝麻是我國重要的優質油料和特色農作物，種植面積十分廣泛，主要分布在河南、湖北、安徽、山東等省，約占世界芝麻總產量的34%，因其含油量高而素有油料作物“皇后”之美譽，具有極高的營養價值[1]。芝麻中以脂肪和蛋白質為主，還含有機酸類、黃酮類、多酚類、木脂素類、維生素及人體必需氨基酸[2-4]、微量元素[5]等營養成分。迄今為止，我國80%以上的芝麻用來榨取芝麻油，芝麻餅粕的年產量超過50萬t。而脫脂后的芝麻粕主要作為飼料或肥料使用，深加工和綜合利用的研究尤顯不足，造成巨大的資源浪費。因此，深入研究開發芝麻粕中對人類有益活性成分非常重要，進而達到最大化利用資源的目的。

目前，對芝麻粕中蛋白質[6-8]、木脂素類[9-10]及其抗氧化活性研究較多，而芝麻粕中多酚及其抗氧化活性的研究鮮有報道[4]。植物多酚又名植物單寧，主要存在于植物的皮、根、葉、果中，在植物中的含量僅次于纖維素、半纖維素和木質素，具有抗氧化、抗衰老、調節免疫、抗炎鎮痛、抗癌抗腫瘤、抗心腦血管疾病和抑菌抗病毒等作用[11]。超聲波法是一種現代分離技術[12-16]，利用超聲波的空化作用、機械作用以及熱效應，可加速細胞壁的破碎，促進胞內有效成分的溶出。因超聲波法提取效率高，已經成為提取植物活性成分研究領域的熱點技術。因此，本文選用芝麻粕為試驗對象，研究超聲輔助乙醇提取芝麻粕中多酚類化合物，采用Box-Behnken設計響應面法對所選試驗參數進行分析和優化，確定芝麻粕中多酚的最佳提取工藝條件；并通過對DPPH·清除作用進行抗氧化活性[17]分析與評價，為芝麻粕的深度開發和綜合利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

芝麻粕，取自山西省神池糧油食品加工廠；沒食子酸丙酯標準品(國藥集團化學試劑有限公司)，實驗用重蒸水溶解制得1 000 μg/mL儲備液；FeSO4·7H2O、C4H4O6NaK·4H2O、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、無水乙醇、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)，均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

UV-1800紫外可見分光光度計，日本島津公司；AB204-N型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器；AL204-N旋轉蒸發儀；501A型超級數顯恒溫水?。籗HZ-D(Ⅲ)型循環水真空泵。

1.2 試驗方法

1.2.1 芝麻粕中多酚的提取

將芝麻粕于100℃真空干燥箱中干燥10 h，粉碎過40目篩，保存備用。準確稱取芝麻粕粉1.000 g于錐形瓶中，加入提取溶劑，設定不同超聲功率、超聲時間、液料比和超聲溫度提取芝麻粕2次，合并提取液，離心10 min除雜，用重蒸水定容于100 mL容量瓶中，保存待測。以多酚產率為指標，采用單因素試驗考察不同提取溶劑、超聲功率、超聲時間、超聲溫度以及液料比對多酚產率的影響。在此基礎上，采用響應面試驗進行工藝優化。

1.2.2 多酚含量的測定

采用酒石酸亞鐵比色法測定。酒石酸亞鐵顯色劑的配制：準確稱取1.00 g硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)和5.00 g酒石酸鉀鈉(C4H4O6NaK·4H2O)，用重蒸水溶解混合定容于1 000 mL容量瓶中。pH為7.4磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液的配制：準確稱取6.02 g含有12個結晶水的磷酸氫二鈉、0.50 g含有2個結晶水磷酸二氫鈉，用重蒸水溶解混合定容于100 mL容量瓶中。

沒食子酸丙酯標準曲線的繪制：準確吸取沒食子酸丙酯儲備液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mL分別置于10 mL比色管中，再各加入5 mL顯色劑，用緩沖液定容至刻度。以試劑空白作參比，在540 nm波長處測定吸光度，得吸光度(A)與沒食子酸丙酯質量濃度(C)的標準回歸方程：A=0.012 4C-0.016 1，R2=0.999 3。

芝麻粕提取液多酚含量的測定：準確吸取2 mL提取液至10 mL的比色管中，然后加入5 mL顯色劑，用緩沖液定容至刻度。以試劑空白作參比，在540 nm波長處測定吸光度，代入回歸方程計算多酚產率，計算公式如下：

式中：C為芝麻粕提取液測得多酚質量濃度，μg/mL；γ為稀釋倍數；V為芝麻粕提取液體積， mL；m為芝麻粕干粉質量，g；106為換算系數。

1.2.3 多酚抗氧化活性(DPPH法)測定

取不同體積芝麻粕多酚提取液及2 mL2×10-4mol/L的DPPH溶液加入10 mL比色管中，搖勻，30 min后用提取液作參比，在517 nm處測定吸光度，同時用蒸餾水作參比，測定2 mL 2×10-4mol/L DPPH 溶液的吸光度，根據下式計算自由基清除率：

式中：A參比為加入蒸餾水時的吸光度；A對照為加入DPPH溶液的體系的吸光度；A樣參為加入不同提取液后的吸光度；A樣品為加入不同提取液+DPPH溶液后體系的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同提取溶劑對多酚產率的影響

多酚是植物體內一類與蛋白質、糖類物質等以氫鍵結合的分子復合物，而多酚物質大多相對分子質量大、羥基數量多，所以提取溶劑不僅需對多酚具有良好的溶解性，而且與多酚更易結合形成氫鍵，才能最大程度地將植物中的多酚溶出。選擇水、甲醇、不同體積分數乙醇溶液、乙酸乙酯、丙酮、氯仿和環己烷等有機溶劑，在超聲功率320 W、超聲時間30 min、液料比50∶1、超聲溫度50℃條件下進行試驗，提取溶劑對多酚產率的影響見圖1。

注：1.水；2.甲醇；3.乙醇；4.20%乙醇；5.40%乙醇；6.60%乙醇；7.80%乙醇；8.環己烷；9.乙酸；10.乙酸乙酯；11.丙酮；12.氯仿。

圖1不同提取溶劑對多酚產率的影響

試驗表明，在超聲電磁強化[18]作用下，多酚在水、甲醇、乙醇/水混合極性溶劑體系中有較好的溶解性；乙酸、乙酸乙酯、丙酮次之，幾乎不溶于氯仿、環己烷。多酚物質一般極性較強，因此易溶于水。試驗發現，對于以縮合單寧為主體的芝麻多酚，體積分數為20%～80%乙醇溶液最適合多酚物質的提取。由圖1可知，隨著乙醇體積分數的增加，多酚產率增大，當乙醇體積分數達80%時，多酚產率有所下降，這可能是因為乙醇體積分數過高使一些脂溶性物質,如葉綠素等[19]的溶出量也增大，不利于多酚的溶出。故本研究選取體積分數為60%乙醇溶液提取芝麻粕中多酚。

2.1.2 超聲時間對多酚產率的影響

固定乙醇體積分數60%、超聲功率240 W、超聲溫度50℃、液料比40∶1，在超聲時間分別為10、20、30、40、50 min下進行試驗，超聲時間對多酚產率的影響如圖2所示。

由圖2可知，隨著超聲時間的延長，多酚產率呈現先增加后降低的趨勢，當超聲時間為30 min時，多酚產率最大。綜合考慮提取成本與效率，選擇超聲時間為30 min。

圖2 超聲時間對多酚產率的影響

2.1.3 液料比對多酚產率的影響

固定乙醇體積分數60%、超聲功率240 W、超聲時間30 min、超聲溫度50℃，在液料比分別為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1下進行試驗，液料比對多酚產率的影響如圖3所示。

圖3 液料比對多酚產率的影響

由圖3可知，當液料比小于50∶1時，隨著液料比的增加，多酚產率增大，這是因為增加液料比，傳質動力增加，多酚就更容易溶出；當液料比大于50∶1時，多酚溶出速率略有所降低。因此，考慮成本與效益，選取液料比為50∶1。

2.1.4 超聲溫度對多酚產率的影響

固定乙醇體積分數60%、超聲功率240 W、超聲時間30 min、液料比40∶1，在超聲溫度分別為30、40、50、60、70℃下進行試驗，超聲溫度對多酚產率的影響如圖4所示。

圖4 超聲溫度對多酚產率的影響

由圖4可知，超聲溫度對多酚產率的影響呈先上升后下降的趨勢，超聲溫度在30～50℃時，多酚產率隨超聲溫度升高而增加，其原因是隨溫度升高，分子運動加快，導致滲透、擴散、溶解速度加快，化合物更易從細胞轉移到溶劑中；由于植物多酚穩定性對溫度變化較敏感[20]，當超聲溫度高于50℃時，導致多酚結構發生變化，多酚產率下降。因此，選擇超聲溫度為50℃。

2.1.5 超聲功率對多酚產率的影響

固定乙醇體積分數60%、超聲時間30 min、液料比40∶1、超聲溫度50℃，在超聲功率分別為160、240、320、400 W下進行試驗，超聲功率對多酚產率的影響如圖5所示。

圖5 超聲功率對多酚產率的影響

由圖5可知，當超聲功率小于320 W時，隨著超聲功率的增大，多酚產率增大，這是因為超聲功率增強，介質質點運動加速，使有效物質迅速溶出，但超聲功率超過320 W時，多酚產率不再增加。綜合分析，選擇超聲功率為320 W時較為理想。

2.2 響應面法優化芝麻粕中多酚提取工藝

在單因素試驗的基礎上，綜合考慮各因素對芝麻粕多酚產率的影響，固定乙醇體積分數為60%，選取對多酚產率相對影響較大的超聲功率(A)、超聲溫度(B)、液料比(C)和超聲時間(D)為因素，以多酚產率(Y)為響應值，按中心組合試驗設計原理，設計四因素三水平的響應面優化試驗，試驗因素水平及編碼見表1，響應面試驗設計及結果見表2。

表1 試驗因素水平及編碼

利用Design-Expert V8.0.6軟件對表2試驗數據進行方差分析和多元回歸擬合。擬合的多元回歸方程為：Y=2.91-0.25A+0.12B+0.09C-0.053D+0.1AB+0.083AC+0.25AD+0.74BC-0.045BD-0.21CD+0.12A2-0.31B2-0.37C2-0.19D2?；貧w模型方差分析見表3。

表2 響應面試驗設計及結果

表3 回歸模型方差分析

注：P<0.01，影響極顯著；P<0.05，影響顯著。

對回歸方程中4個因素分別求偏導，并令一階導數等式為零，解方程可得到4個因素的最佳水平值，分別為：A=0.953 8,B=0.481 8,C=0.697 5,D=0.045 5，轉換后得到提取的最佳條件為：超聲功率316 W，超聲溫度54℃，液料比57∶1，超聲時間30 min。通過回歸方程計算，多酚產率最大理論值為2.95%。

2.3 芝麻粕中多酚提取優化工藝驗證

考慮到生產成本及儀器的可操作性，將優化工藝條件校正為：超聲功率320 W，超聲溫度54℃，液料比57∶1，超聲時間30 min。在修正后優化條件下進行驗證性試驗(n=3)，多酚產率平均值為2.86%，與理論預測值相對誤差為3.05%。用Box-Behnken設計響應面法得到的試驗模型對提取芝麻粕中多酚工藝條件穩定可靠。

2.4 芝麻粕多酚提取液對DPPH·的清除作用

DPPH具有較活潑的化學性質，極易形成自由基。在反應體系中對DPPH·的清除率越高，表明物質的抗氧化能力越強[17]。試驗選擇質量濃度相近的食品抗氧化劑叔丁基對苯二酚(TBHQ；CTBHQ=66.00 μg/mL)與芝麻粕多酚提取液(C=65.87 μg/mL)作對比，結果如圖6所示。

圖6 芝麻粕多酚提取液對DPPH·的清除作用

由圖6可知，芝麻粕多酚提取液及TBHQ對DPPH·的清除率隨著加入量增加而增大，分別加入相同質量濃度的芝麻粕多酚提取液和TBHQ，芝麻粕多酚提取液抗氧化能力明顯優于TBHQ。這是因為芝麻粕多酚是一個復雜成分體系[1-5]，其中包括單寧、低相對分子質量的酚、黃酮類化合物，甚至糖類和色素。由圖6也可知，當DPPH·清除率為50%時，芝麻粕多酚提取液IC50為34.91 μg/mL，TBHQ的IC50為92.40 μg/mL。因此，芝麻粕多酚具有較強抗氧化活性。

3 結 論

(1)在單因素試驗的基礎上，以多酚產率為指標，選取超聲功率、超聲溫度、液料比及超聲時間4個因素進行中心組合設計，建立了超聲提取芝麻粕中多酚工藝的數學模型：Y=2.91-0.25A+0.12B+0.09C-0.053D+0.1AB+0.083AC+0.25AD+0.74BC-0.045BD-0.21CD+0.12A2-0.31B2-0.37C2-0.19D2。該模型的穩定性較好。通過模型顯著性檢驗，得到因素的主效應關系為：超聲功率>超聲溫度>液料比>超聲時間。最佳的工藝條件為以60%乙醇溶液為提取溶劑、超聲功率320 W、超聲溫度54℃、液料比57∶1、超聲時間30 min,在此條件下進行驗證性試驗，多酚產率為2.86%，與理論產率相近。

(2)對比研究了芝麻粕多酚提取液與TBHQ抗氧化能力，芝麻粕多酚提取液清除DPPH·IC50為34.91 μg/mL，TBHQ的IC50為92.40 μg/mL，芝麻粕多酚有較強清除自由基作用，芝麻粕雖然是提取油料的副產物，有望作為天然抗氧化劑和功能性食品而得到開發利用。