木犀草素對結腸癌細胞抑癌基因RECK表達的影響及機制研究

魏付橋 陽樂彬 王春云 鄧豪 唐金濤 謝文彪

421001南華大學附屬第二醫院胃腸外科，湖南 衡陽

結直腸癌是胃腸外科最常見的惡性腫瘤。隨著我國人民生活水平的提高，蛋白攝入量日益增多，近年來結直腸癌的發病率逐漸增高。因此開展本病研究有利于提高本病的治愈水平。和其他惡性腫瘤一樣，結直腸癌的發病也是細胞增殖與凋亡失調的結果，從基因角度來說，涉及癌基因與抑癌基因的改變。RECK 是近年來發現的一種新型抑癌基因，在包括結直腸癌在內的多種腫瘤細胞中，RECK 呈低表達或不表達，且在腫瘤細胞中其基因啟動子區域呈甲基化而失活[1]。此外，RECK 也與腫瘤的侵襲性呈負相關。因此，采用藥物干預，提高其表達水平，是治療結直腸癌的重要思路。本研究旨在探討木犀草素對結腸癌細胞抑癌基因RECK 表達的影響，并初步探討其機制。

資料與方法

主要實驗材料：人結直腸癌細胞系HCT116 源自美國ATCC。鼠抗人RECK多克隆抗體、RECK 引物由上海生工合成。RNA提取試劑盒、定量PCR試劑盒。DNMT1活性試劑盒，Sp1活性試劑盒。

細胞培養與處理：將HCT116 細胞用DMEM(Hyclone)培養基中，含有10%(V/V)胎牛血清，以及100 U/mL 青霉素G和100 μg/mL 鏈霉素的培養基中，在37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。細胞處理前先調整其密度為5×104/mL，隨后根據不同的實驗目的將細胞接種于96孔板或6孔板中，12～24 h后加入終濃度為5、10和20 μmol/L木犀草素作用不同時間。

Western blot 檢測RECk 蛋白表達：用含有蛋白酶抑制劑混合物和PMSF的裂解緩沖液裂解。測定蛋白質濃度后。蛋白經10%～15%SDS-PAGE 分離并轉移到PVDF 膜上。室溫下用含5%脫脂奶粉封閉膜1 h，然后與一抗在4℃溫育過夜。最后將膜與HRP 標記的二抗溫育1 h，最后化學發光、顯影，并計算灰度值。

定量PCR 檢測RECK mRNA 表達：采用Roche LightCycle 480 系統進行實時RT-PCR。RT-PCR 的初始步驟在50℃2 min，隨后95℃下進行10 min 后，進入40 個擴增循環：95℃15 s，然后在60℃退火1 min。最后60℃1 min。計算所有樣品的Ct值，并計算相對表達量。

DNA 甲基轉移酶1 和Sp1 活性分析：獲取處理后的HCT116 細胞提取核蛋白，測定其蛋白濃度后，分別測定DNMT1 和Sp1 的活性。該試劑盒上包被有Dnmt 或Sp1 吸附基質，樣品中的Dnmt1 或Sp1 結合到基質上，能被特異性的抗體識別，可通過ELISA法測定其吸光度，活性與顯色程度呈線性關系。

統計學方法：采用SPSS 統計學軟件分析數據，所有結果重復3 次。組間比較采用方差分析后用SNQ 法進行兩兩比較；P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

不同濃度木犀草素上調RECK 蛋白表達：Western blot 結果顯示，對照組RECK 的灰度值為(0.12±0.04)，經5、10和20 μmol/L 木犀草素處理后，灰度值分別為(0.22±0.04)、(0.34±0.01)和(0.42±0.02)。與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。

不同濃度木犀草素上調RECK mRNA表達：實時定量PCR 結果顯示，5、10和20 μmol/L 木犀草素處理后，RECK mRNA 的相對表達量分別為(1.15±0.02)、(1.67±0.03)和(2.68±0.05)，與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。

不同濃度木犀草素抑制人DNA 甲基轉移酶1(DNMT1)表達：對照組DNMT1活性較高。5、10和20 μmol/L木犀草素處理后，酶活性分別為對照組的(91±3.14)%、(84.6±4.16)%和(75.3±2.61)%。與對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.05)。

不同濃度木犀草素抑制Sp1 活性：ELISA 方法結果也顯示，HCT116 細胞靜息狀態下Sp1 活性較高。給予不同濃度木犀草素孵育24 h 后，隨著木犀草素濃度的增高，Sp1活性逐漸降低。

討 論

RECK 基因是近年新發現的一個抑癌基因，其主要功能是能抑制腫瘤細胞的侵襲與轉移。研究表明，RECK 的表達水平與惡性腫瘤患者的生存率呈明顯的正相關。RECK 通常在身體的所有細胞中表達，在細胞外基質(ECM)的生成與降解中起著重要作用。RECK 是基質金屬蛋白酶的抑制劑，后者可分解細胞外基質，并能促進新生血管的形成[2]。而ECM 的降解和新血管的動員是腫瘤侵襲與轉移的必備條件。若腫瘤在這些功能方面受到抑制，腫瘤將停止生長。因此，RECK 是一種潛在的抑制劑，也是早期臨床階段可用的預后標志物。木犀草素是植物中的一種天然黃酮類化合物。富含木犀草素的蔬菜和水果包括胡蘿卜、花椰菜、洋蔥葉、歐芹、芹菜、甜椒和菊花。木犀草素具有很強的抗癌、抗炎和抗氧化活性，在許多類型的癌細胞中可以逆轉多藥耐藥(MDR)。它還可以改善各種化療藥物可能引起的細胞毒性[3]。盡管木犀草素有很好的抗癌特性，但它們的確切作用還不清楚。本研究發現，木犀草素不但可上調RECK 的mRNA 和蛋白表達水平，同時也能下調細胞內DNMT1 和核轉錄因子Sp1 的活性，后者是介導DNA 甲基化的重要分子。木犀草素對甲基化的抑制，能有效改善RECK 的甲基化狀態，從而激活并重新誘導RECK 表達，最終發揮對腫瘤細胞的侵襲與轉移的抑制作用。在未來的研究中，將對其作用機制開展進一步探討。

攻讀經典 力求實用

中醫人讀書要廣泛涉獵。中醫的思想受佛、道兩家思想的影響，尤其是佛家的思想。《黃帝內經》包含《素問》《靈樞》兩個部分，《靈樞》《素問》都包含八十一篇。《難經》也是八十一篇，這些都是受佛教的影響。佛教認為，人生要度過八十一個關口，《西游記》中唐玄奘也是經歷了八十一難才取回了佛教真經。而佛教思想也滲透到了醫學、藥學的領域，比如君主之官、相傅之官雖然都是外界詞匯，但卻滲入了中醫學說中。

在讀經典文獻時，不能死記硬背，應該活學活用。“一寸光陰一寸金，寸金難買寸光陰”，要把時間用到研讀重要的文獻中去。在研讀經典的過程中，要注意各個經典的結合，把死書讀活，才能有所收獲，否則就是浪費時間。除此之外，在讀經典時，不能浮光掠影、走馬觀花的讀書，要一字一句地認真研讀。

有些人不重視《神農本草經》。《神農本草經》中記載了許多藥物性能，但許多人認為它過時了，其實不然，《神農本草經》才是認識藥物性能的關鍵。以人參為例，1957年，筆者在靈巖寺給學生講《傷寒》《金匱要略》時，講到了人參湯可生津止渴，而大家平時了解的人參都是溫陽的。原來這種止渴的人參是山西黨參而非東北人參，這種差異在《神農本草經》中就有記載。如果不讀《神農本草經》，就無法了解到這一點。

讀《黃帝內經》時，要重點汲取《黃帝內經》的精華部分，先瀏覽，尋其精華，熟稔于心。但也不能被其束縛住，讀時應當安心定神，“進得去，又能出得來”。

《傷寒論》為必讀之書，歷代單注解《傷寒論》的著作就有六百多本。筆者主張要讀原文先不看注解，這樣就不會讓注解中他人的思想先入為主，影響自己的思考。《傷寒論》在流傳、整理及印刷的過程都有可能出現許多錯字和張冠李戴現象，給后人學習研究造成困難。又如六經提綱中，太陽病表證與其他疾病有相似之處，然而給溫病戴上太陽病的帽子是不合適的。再如書中三陰三陽、六經學說概念歷代學者幾百年爭論不休，浪費幾多光陰。而要做的就是辨證施治，力求實用，能夠跳出三界外不在五行中，把死書用活。

讀書還要注重其實用性。大家要熟練運用經典中的方藥，《傷寒論》中112張處方要背得滾瓜爛熟，達到信手拈來的境界，且要注意用藥規律和特點。例如甘草，《傷寒論》中寫到甘草90%為炙甘草，而《金匱要略》中則用生甘草。如葛根，有解肌發表、升陽舉陷、舒經活絡、解酒毒的功效，亦可治療項背強幾幾，不過應當注意僅在無汗時可用。如黨參，可以止渴，然《傷寒論》《金匱要略》中并不是黨參一家。如附子，可溫理祛寒、溫陽，用時要注意是生附子還是熟附子。