病毒性腦炎患兒細胞因子和免疫功能的臨床研究

王躍生 張 敬 李小芹

鄭州大學附屬兒童醫院/河南省兒童醫院/鄭州兒童醫院，河南 鄭州 450003

病毒性腦炎(viral encephalitis，VE)是兒童最多見的中樞神經系統感染性疾病之一。各種病毒均可引起的急性顱內炎癥，主要臨床表現為發熱、顱內壓增高、部分神經功能缺損、意識不同程度障礙、癲癇及驚厥發作，其病情輕重差異較大[1-2]。病毒感染機體后，多種免疫細胞應答活化，激活的淋巴免疫細胞經損傷的血腦屏障侵入中樞神經系統，神經元和神經膠質細胞受到感染后與淋巴細胞共同釋放大量細胞因子，從而介導中樞神經系統發生炎癥反應[3]，早期發現合理診治尤為重要[4]。本研究主要分析病毒性腦炎患兒體內細胞因子水平、細胞免疫功能狀態，從而揭示腸道病毒感染后對機體的影響。

1 對象與方法

1．1研究對象選擇2014-05—2017-05在鄭州兒童醫院消化科住院患兒60例，入選標準：①年齡：1～5歲；②入選患兒病史及輔助檢查均診斷為病毒性腦炎[5]，且發病在急性期(發病8d以內)臨床表現為發熱、頭痛、嘔吐、精神差、抽搐等癥狀。③確診病毒性腹瀉病例：在腹瀉糞便標本中檢測出輪狀病毒、杯狀病毒、星狀病毒、腸道腺病毒。④排除嚴重心肺疾患，或有嚴重的腦外傷，或有嚴重免疫缺陷及既往有腦損傷病史或神經系統腫瘤。分為單純腸道病毒感染患兒30例、合并病毒性腦炎患兒30例。男39例，女21例，平均年齡(4.1±1.2)歲；比較2組患兒在入院病情嚴重程度、年齡、性別方面，差異無顯著統計學意義(P>0.05)。

1．2測定指標及方法

1．2．1 測定指標：測定2組患兒第1、14天外周血IL-2、IL-6、TNF-α水平，流式細胞儀檢測CD3+T細胞，CD4+T細胞，CD8+T細胞，NK細胞相對活性，外周血CD4+/CD8+比值。

1．2．2 測定細胞因子：清晨空腹采集患兒治療第1、14天靜脈血2 mL，離心機分離血清后，使用ELISA方法，進行IL-2、IL-6以及TNF-α定量檢測。檢測步驟按照試劑盒說明書程序操作，試劑盒均購自博士德生物科技有限公司。

1．2．3 流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群：2組患兒于治療第1、14天清晨空腹時采集2 mL靜脈血標本，肝素鈉抗凝處理，分別取100 μL加入適當比例相應抗體混勻。避光孵育半小時后加入紅細胞裂解液，半小時反應后立即檢測，采用FACS Calibur型流式細胞儀(BD公司，美國)對全血標本中CD3+T細胞,CD4+T細胞，CD8+T細胞以及NK細胞進行檢測，并測定CD3+T淋巴細胞計數，NK細胞相對活性，外周血CD4+/CD8+細胞比值。

1．2．4 病毒性腹瀉檢測：腹瀉患兒入院24 h內收集標本，或腹瀉3 d內的糞便。標本采集后立即予-20 ℃冰箱保存。所有標本由國家疾控中心病毒所腹瀉室進行統一檢測，檢測內容包括HRV、HuCV、EAdV、HAstV抗原檢測。HRV使用酶聯免疫試劑盒進行抗原檢測，HuCV、EAdV、HAstV直接使用PCR的方法進行檢測。

2 結果

2．1 2組患兒血清炎癥因子的表達2組患兒發病初期體內細胞因子水平均明顯升高。與治療第1天相比，第14天所有患兒血清IL-2、IL-6及TNF-α均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；第14天單純病毒感染組較合并病毒性腦炎患兒IL-2、IL-6及TNF-α水平降低更明顯，差異有統計學意義(P<0.01，表1)。

2．2 2組細胞免疫功能的表達2組患兒發病初期細胞免疫表達均下調。與治療第1天相比，第14天2組CD3+T細胞、NK細胞相對活性及外周血CD4+/CD8+比值較治療前顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；第14天單純病毒感染組較合并病毒性腦炎組CD3+T細胞、NK細胞相對活性及外周血CD4+/CD8+比值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

3 討論

兒童病毒性腹瀉病病原主要為：輪狀病毒、人類星狀病毒、人杯狀病毒、腸道腺病毒[6、7]。腸道病毒感染患兒早期產生的大量IL-2、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子破壞毛細血管內皮，導致組織損傷[8]，微血管循環障礙及微血管壁通透性增加，誘發全身組織炎癥反應。研究發現，炎癥因子在病毒性腦炎患兒多個病程階段進行調節[9]。Th1細胞活化后產生IL-2，IL-2刺激巨噬細胞分化、促進NK細胞增殖及CTL細胞成熟分化，介導細胞免疫發生；增加IL-2R在T細胞表面的表達，刺激其他細胞因子的分泌。正常功能的IL-2能增強免疫系統的活性，調節感染的免疫應答及免疫病理的過程，從而抑制病毒感染及其它相關病理變化。但是，若IL-2的產生或表達異常可導致疾病的發生。IL-6因子介導B細胞產生抗體，促進B細胞分化，活化T細胞增殖，促進T細胞分化為CTL細胞；可降低TNF-α活性和誘導急性期蛋白的產生，起到抗炎作用，增強T細胞的免疫及細胞功能，促進B細胞分泌表達特異性抗體[10]，抗體清除抗原，降低炎癥反應，對中樞神經系統抗損傷防御起到重要作用[11-12]。IL-6亦可誘導機體免疫細胞抗病毒，與巨噬-粒細胞集落刺激因子共同作用使免疫細胞增殖分化，誘導T細胞的祖細胞生成CTL細胞，進一步介導組織免疫損傷；IL-6作為內源性致熱源參與炎癥反應，使炎癥反應增強并持續。既往研究發現，IL-2、IL-6參與機體局部的免疫應答反應，其介導免疫失衡過程中具有關鍵的作用[13-14]。TNF-α是一種促炎細胞因子，由單核-巨噬細胞分泌合成，具有多重生物學行為，主要來源于中樞神經系統的星形膠質細胞和小膠質細胞，當中樞神經系統感染時，病原體透過血腦屏障侵犯腦組織時，病毒直接刺激和炎性因子的作用下導致TNF-α高水平表達[15-16]，病菌感染時介導炎癥傳遞，引起宿主組織細胞嚴重的發熱、休克等病理損害，進而促進炎癥反應的進展。腦組織在病毒直接刺激和炎性因子的作用下，對腦組織細胞的抑制或殺傷越明顯[17-18]。

表1 2組血清炎癥因子的表達Table 1 Expression of serum inflammatory factors in 2

表2 2組細胞免疫的表達Table 2 Expression of cellular immunity in 2

研究揭示炎癥因子的檢測有助于病毒性腦炎的診斷[19-20]，合并癲癇患兒炎癥反應更明顯[21]。本研究2組患兒發病早期IL-2、IL-6、TNF-α水平均明顯增高，腸道病毒合并病毒性腦炎患兒細胞因子水平明顯高于單純腸道病毒感染患兒，表明病毒性腦炎患兒體內存在炎癥過度反應；經治療后上述指標明顯下降，但合并腦炎患兒細胞因子水平在第14天仍高于單純腸道病毒感染組。推測病毒性腦炎患兒腦組織細胞損傷后刺激炎性因子，激活細胞因子級聯反應，從而加重腦炎患兒病情。因此，細胞因子變化可以預測病毒性腦炎患兒嚴重程度。

機體免疫系統主要由細胞免疫、體液免疫及固有免疫構成。其中T淋巴細胞是清除病毒感染重要的免疫細胞，體內的細胞免疫功能所處的狀態由它的數量及功能反映。目前主要由流式細胞儀測定T細胞亞群，是判定細胞免疫功能高低的主要方法之一。NK細胞作為固有免疫的關鍵細胞，是機體抵抗外來病毒感染的首要屏障，可直接識別并殺傷病毒感染，還可分泌IFN、TNF等細胞因子干擾病毒復制，吞噬細胞活化增殖，提高機體抵抗病毒感染的防御能力，在阻止腸道病毒感染機體的過程中起到重要作用。機體感染腸道病毒后，激活免疫細胞，免疫系統活化并啟動應答[22]，病毒感染神經系統時破壞血腦屏障功能，侵入中樞神經系統的活化T淋巴細胞與神經組織細胞共同釋放大量IL-2、IL-6、TNF-α炎性因子，從而介導腦組織產生炎癥損傷[23-24]。 因此，病毒感染直接導致機體免疫功能損傷、紊亂，激活T淋巴細胞介導中樞神經系統炎癥免疫損傷[25]。根據T淋巴細胞在免疫應答中不同作用分為多個亞群，可激活巨噬細胞增殖、促進B淋巴細胞和自然殺傷細胞及CD8+淋巴細胞分化成熟，產生分化因子和生長因子[26]。機體正常的 免疫應答由CD4+、CD8+細胞數量、NK細胞的活性，及不同細胞亞群間相互信息的傳遞所決定[27]。CD4+、CD8+T細胞相互制約產生適度的免疫應答，既能清除病原體又不損傷自身組織，處于動態平衡的狀態，機體免疫抑制時CD4+/CD8+比值的降低，當比值的升高時可上調機體細胞免疫功能，機體免疫功能的穩定有賴于其比值動態平衡。NK細胞是機體重要的抗感染及抗腫瘤免疫防御細胞，NK細胞活性增加及功能恢復利于機體清除感染，保護組織臟器功能，病毒性腦炎患兒NK細胞明顯受損[28]，NK細胞功能減低或者功能缺陷會發生嚴重的腸道病毒的感染，機體發生細胞免疫紊亂，產生過量的細胞因子，擴大炎癥反應范圍，侵犯中樞神經系統時，血管內皮細胞損傷，血管通透性增加，繼發產生多種神經毒物質，直接或間接加重腦組織水腫[29]，輕重癥病毒性腦炎均存在細胞免疫紊亂，臨床癥狀與細胞紊亂呈正相關，與臨床預后正相關。同時，病毒性腦炎患兒伴隨免疫力低下，臨床發展結局與機體免疫功能密切相關[30]。因此，CD3+T細胞的表達，外周血CD4+/CD8+比值的平衡及NK細胞相對活性可反映機體的免疫功能狀態。

CD3+T細胞測定反映總T細胞計數，機體總體細胞免疫功能狀態。CD4+T細胞主要為輔助性Th細胞，在機體的免疫應答過程中受到抗原刺激后，由不同的細胞因子介導分化成的不同亞群，包括Th1、Th2、Thl7細胞和調節性T淋巴細胞(Treg)，Th1在機體細胞免疫應答與遲發性超敏反應起主導作用，并刺激B細胞產生免疫球蛋白。而Th2可分泌IL-4、IL-5、IL-9等細胞因子，參與體內體液免疫應答，協同B細胞生成特異性IgE，發揮機體非吞噬功能的防御反應。人體的正常免疫功能有賴于Thl與Th2間動態平衡[31-36]。CD8+T細胞活化后可參與病毒的清除過程，是清除病毒的重要效應細胞。同時，機體細胞免疫系統的應答調節與病毒性腦炎患兒預后有顯著相關性[37-40]。本研究2組患兒發病初CD3+T細胞、 NK細胞相對活性、CD4+/CD8+比值均低于正常值，提示腸道病毒感染患兒機體處于免疫抑制狀態，細胞免疫功能的低下與紊亂。治療后較前升高，但腸道病毒感染合并腦炎患兒NK細胞相對活性、CD4+/CD8+比值顯著低于單純腸道病毒感染者，推測可能與腸道病毒感染合并病毒性腦炎患兒機體下調細胞免疫功能有關[41-42]，且感染程度嚴重的細胞免疫抑制更明顯，病毒進入腦脊液加速神經細胞損傷，從而揭示病情嚴重程度與免疫功能存在負相關，調節免疫利于病毒性腦炎的恢復[43-47]。

腸道病毒感染患兒存在免疫功能紊亂、細胞因子激活狀態，且與病情嚴重程度存在相關性，患兒臨床癥狀越重，細胞紊亂越嚴重，患兒預后也越差。早期全面了解機體免疫功能，為病毒感染治療提供了重要線索，從而降低并發癥的發生率。