丁苯酞預處理對腦缺血再灌注大鼠CHOP及Caspase-3的影響

高 蘭

鄭州市中心醫院，河南 鄭州 450000

內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在再灌注細胞凋亡過程中至關重要[1-2]。內質網上跨膜蛋白肌醇依賴酶1(IRE1)作為ERS感受器具有重要調節作用，其可通過激活下游的凋亡信號分子CHOP，活化Caspase-3導致細胞凋亡[3-5]。近年來，藥物預處理已成為國內外研究的熱點[6]。丁苯酞能夠阻斷腦卒中多個病理環節，從而治療急性缺血性腦卒中。丁苯酞預處理能否提高神經細胞對腦缺血的耐受性仍在初期研究階段。本實驗通過對再灌注損傷中IRE1通路相關因子的檢測，為進一步探討預防性藥物治療在降低缺血性腦卒中的發病率中的作用。

1 材料與方法

1．1動物與分組健康雄性Wistar大鼠共72只，體質量250～280 g，由鄭州大學實驗動物中心提供。隨機分成假手術組、缺血再灌注組、丁苯酞預處理組，各組分別在再灌注后6 h、12 h、24 h分為3個亞組，每組8只。各組按實驗要求分別在不同時間點分別進行CHOP、Caspase-3免疫組化測定。

1．2主要試劑丁苯酞膠囊(石藥集團恩必普藥業有限公司提供)。兔抗鼠CHOP單克隆抗體、兔抗 Caspase-3 抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，SP免疫組化試劑盒、DAB染色劑試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)。

1．3方法將丁苯酞膠囊溶于生理鹽水配成10 mg/mL混懸液，使用前充分搖勻，以50 mg/(mg·d)的劑量術前灌胃5 d，其余2組相應給予等體積生理鹽水。

1．4動物模型的制備采用Zea Longa線法[7]制備右側大腦中動脈缺血再灌注大鼠模型：首先10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠。取仰臥位固定后消毒，取頸部正中切口，鈍性深部分離頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，先結扎CCA和ECA，眼科剪在ECA剪一小口，并將消毒后的線栓插入ECA，后經CCA分叉處進入ICA，線拴插入深度(18.5±0.5)mm，稍感阻力時扎緊并固定線栓。缺血2 h后抽提線栓實現再灌注。假手術組不插線拴，其余步驟同上。再灌注后在設計觀察時間點處死動物取腦，按Zea Longa 5分制進行評分，1～3分的大鼠入實驗組。

1．5 SP法免疫組織化學測定缺血再灌注不同時間點用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，依次生理鹽水、4%多聚甲醛溶液快速心臟灌注，內固定后開顱取腦，選取視交叉前后2 mm的腦組織，多聚甲醛溶液4 ℃固定72 h，常規梯度乙醇脫水，石蠟包埋冠狀切片。片厚4 μm，其后用SP免疫組化法測定CHOP、Caspase-3表達。每張切片隨機選取5個不重疊視野在高倍鏡10×40觀察拍照，顯微鏡下胞質或胞核有棕黃色顆粒者為陽性細胞。

2 結果

2．1丁苯酞預處理對CHOP活性的影響假手術組腦組織內CHOP的陽性細胞微量表達，與假手術組比較，缺血再灌注組CHOP陽性表達6 h時少量增加，12 h時表達逐漸升高，24 h時達峰。與模型組比較，丁苯酞預處理組可降低腦CHOP的表達(P<0.01)。見表1。

2．2丁苯酞預處理對Caspase-3的影響假手術組腦組織內Caspase-3染色陽性細胞微量表達，與假手術組比較，缺血再灌注組Caspase-3陽性細胞變形且體積變小，其表達6 h少量增加，12 h進一步升高，24 h明顯增加。與模型組比較，丁苯酞預處理在6 h、12 h時差異無統計學意義，但24 h時Caspase-3表達陽性染色細胞減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠CHOP表達比較Table 1 Comparison of the expression of CHOP in each

注：與假手術組比較，△P<0.01；與缺血再灌注組比較，▲P<0.01

表2 各組不同時間點Caspase-3的表達Table 2 Caspase-3 expression on rats in each

注：與假手術組比較，△P<0.05；與缺血再灌注組比較，▲P<0.05

3 討論

腦缺血再灌注后鈣離子平衡失調、氧化應激損傷等均會導致誤折疊蛋白的積累，誘發內質網應激，最終導致細胞內質網內穩態失衡，生理功能發生紊亂[8-11]。LI等[12-13]研究顯示，通過減弱內質網應激可以保護腦免受缺血再灌注損傷。誤折疊蛋白反應(UPR)是內質網穩態失衡后發生的適應性信號反應，其作用是增加正確蛋白的合成并減少誤折疊蛋白負荷，從而恢復內質網穩態，促進細胞存活[14-16]。嚴重持續的ERS，適應性的保護機制無法有效恢復內質網功能，UPR則轉化為促凋亡模式導致細胞凋亡[17-19]。UPR通路由內質網上3種跨膜蛋白RNA依賴的內質網激酶樣激酶(PERK)、肌醇依賴酶 1(IRE1)和活化的轉錄因子 6(ATF6)作為ERS感受器執行[20-22]。其中IRE1通路是UPR信號轉導中一個重要的調節樞紐[23-25]。嚴重ERS時，激活的IRE1信號通路則啟動凋亡程序，通過激活下游的凋亡信號分子CHOP介導細胞凋亡[26-27]。CHOP又稱DNA損傷基因，是內質網應激特異的轉錄因子。CHOP缺陷則能保護細胞對抗內質網應激誘導的凋亡[28-31]。正常情況下CHOP表達很低，嚴重持久ERS，過度表達的CHOP通過抑制凋亡負調節蛋白Bcl-2，或增加促凋亡死亡受體5蛋白的表達，進而激活Caspase家族導致細胞凋亡[32-35]。Caspase-3是凋亡的關鍵酶和執行者，在凋亡最后程序中起關鍵作用[36-38]。因此，抑制IRE1信號通路下游凋亡信號分子CHOP及作為凋亡執行者的Caspase-3，對減輕再灌注損傷具有一定的意義。本實驗顯示，與假手術組相比，缺血再灌注6 h時CHOP表達開始增加，再灌注12 h時繼續升高，24 h達峰；伴CHOP表達增多，在相對應再灌注時間點Caspase-3表達也逐漸增加。表明再灌注模型不同時間點Caspase-3表達增加與CHOP表達增多密切相關。

藥物預處理是指在嚴重缺血之前給予的保護性干預措施?？赡軝C制指通過藥物激發或模擬機體內源性物質，使腦組織在面臨預處理后更為嚴重的損傷時具有較強的抵抗力，是近年來關注的熱點問題。丁苯酞是中國第一個擁有自主知識產權的國家類化學新藥[39]?？赏ㄟ^抑制血小板集聚、抗自由基、恢復能量代謝等多種藥理作用改善腦卒中后神經功能缺損癥狀[40]。既往研究多側重于對缺血性腦血管病的治療，但丁苯酞預處理能否通過提高神經細胞對腦缺血的耐受性仍在初期研究階段，具體機制還不清楚。

本實驗觀察了丁苯酞預處理對凋亡信號分子CHOP及Caspase-3活性的影響，結果顯示，與模型組比較，丁苯酞預處理組在再灌注24 h時CHOP、Caspase-3表達明顯降低，表明丁苯酞預處理可能通過抑制IRE1通路轉錄因子CHOP，減少Caspase-3的表達，進而減輕內質網應激導致缺血再灌注損傷，為丁苯酞在預防性用藥、減少腦卒中發生及減輕神經功能缺損等方面提供了實驗室依據。