聯合檢測Sp1、KLF8、Cyclin D1及P16在卵巢漿液性腫瘤中的表達及預后意義

顧靜鳳 陳芳 張菊平 高小姣 鄧志勇(通訊作者)

215300昆山第一人民醫院，江蘇 昆山

卵巢惡性表面上皮-間質腫瘤占卵巢惡性腫瘤的90%以上[1]，其中漿液性腫瘤比例最高，但由于解剖部位隱蔽、內分泌功能復雜及臨床癥狀不典型，導致不能早期及時準確診斷，5年存活率始終徘徊在30%上下[2]，且不同患者預后差異很大。因此，尋找特異的預后指標和靶向治療分子顯得尤為重要。免疫組化染色在鑒別卵巢漿液性腫瘤與分級等方面有一定的意義，目前應用于卵巢漿液性腫瘤診斷與預后的3 個指標是：轉錄因子特 化 蛋 白 -1(transcription specificity protein 1)Sp1、多腫瘤抑制基因(MTS1)P16、局部黏著斑激酶(FAK)KLF8。而細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是近幾年卵巢漿液性腫瘤在分子遺傳學方面的研究熱點，是KRAS/BRAF/MEK/MAPK 信號通路中的一個下調靶點，過度表達于卵巢交界性腫瘤或低級別漿液性癌中[3]。本文聯合檢測Sp1、KLF8、P16 及Cyclin D1在卵巢漿液性腫瘤中的表達及相關性的研究，并分析其臨床病理特征及預后，旨在提高卵巢漿液性腫瘤的病理診斷的準確率。

資料與方法

2008年1月-2017年12月選取手術切除的卵巢漿液性囊腺癌石蠟標本50 例作為觀察組，術前均未行化療、放療或激素治療，有完整的臨床病理；同時收集同期存檔的卵巢漿液性囊腺瘤及卵巢交界性漿液性囊腺瘤各20 例作對照組。觀察組患者年齡27～82 歲，平均52歲；＜50 歲19 例，≥50 歲31 例；臨床分期采用國際婦產科聯盟(FIG0)2000年標準，Ⅰ期19例，Ⅱ期11例，Ⅲ期、Ⅳ期20 例；術后證實有淋巴結轉移者14例，無淋巴結轉移者36 例。組織分級采用WHO 標準，高級別28 例，低級別22 例；主要試劑：Sp1 及KLF8 單抗隆抗體；Cyclin D1 兔抗人單克隆抗體及P16 鼠抗人單克隆抗體；DAB顯色試劑盒。

方法：采用免疫組化SP 法染色，具體操作步驟按試劑盒說明書進行，陽性對照選擇已知的陽性病理切片，陰性對照選擇磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。

結果判定：P16 的陽性表達定位于細胞核及部分細胞質，Sp1、KLF8 及Cyclin D1 的陽性表達定位于細胞核，陽性反應的判斷標準為于蛋白表達定位區有棕褐色或棕黃色顆粒出現，隨機選取10 個有代表性的高倍鏡視野，每個視野計數100 個腫瘤細胞，評分依據著色度與著色細胞百分比計分的乘積進行，陽性表達率的計算方法為陽性細胞數/總細胞數×100%[4]。

統計學方法：采用SPSS 18.0 統計學軟件分析數據。計數資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗，相關分析采用Spearman秩相關性；P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

Sp1、KLF8、Cyclin D1和P16在卵巢漿液性腫瘤中的表達情況：Sp1在卵巢漿液性囊腺癌、交界性漿液性囊腺瘤和漿液性囊腺瘤中的表達率依次降低，分別為68.0%、25.0%和15.0%，三者比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，但交界性漿液性囊腺瘤和漿液性囊腺瘤相比，其表達比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。在卵巢漿液性囊腺癌、交界性漿液性囊腺瘤和漿液性囊腺瘤中KLF8陽性表達率依次降低，分別為64.0% 、40.0% 和10.0%，三者比較，差異有統計學意義(P＜0.05)；Cyclin D1 在卵巢漿液性囊腺癌、交界性漿液性囊腺瘤和漿液性囊腺瘤中的陽性表達率分別為48.0%、80.0%和20.0%，每兩組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)；P16 在卵巢漿液性囊腺癌、交界性漿液性囊腺瘤和漿液性囊腺瘤中的表達率依次升高，分別為18.0%、50.0%和70.0%，三者比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，但交界性漿液性囊腺瘤和漿液性囊腺瘤相比，其表達比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。

Sp1、KLF8及Cyclin D1、P16表達與卵巢漿液性囊腺癌臨床病理特征的關系：Sp1的陽性表達率與患者臨床分期及淋巴結轉移呈正相關，FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期患者中Sp1 蛋白的陽性率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期，Sp1蛋白的陽性率淋巴結轉移患者顯著高于無淋巴結轉移者，差異有統計學意義(P＜0.05)，與患者年齡及病理分級無相關性(P＞0.05)。P16的陽性表達率與病理分級、臨床分期有關(P＜0.05)。P16 在Ⅲ～Ⅳ期卵巢漿液性癌中的表達低于Ⅰ～Ⅱ期；在高級別癌中的表達低于低級別癌，差異有統計學意義(P＜0.05)，與患者年齡、淋巴結是否轉移無相關性(P＞0.05)。

KLF8、Cyclin D1 的陽性表達率與患者的臨床病理特征包括患者年齡、病理分級、淋巴結轉移及臨床分期均無相關性(P＞0.05)。

討 論

Sp1 和KLF8 同屬于Sp1/KLFs 家族，均是具有鋅指結構的轉錄因子，本研究發現，Sp1陽性率在卵巢漿液性囊腺癌中高于卵巢交界性囊腺瘤及漿液性囊腺瘤，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示Sp1可能參與了卵巢漿液性囊腺癌的發生和發展，其也可以作為卵巢漿液性囊腺癌的診斷指標。臨床分期及淋巴結轉移與否和Sp1 關系密切，呈顯著正相關，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示在卵巢漿液性囊腺癌的侵襲與轉移過程中，Sp1可能起到了一定的作用，其是卵巢漿液性囊腺癌預后不良的一個因素，在分析腫瘤浸潤和臨床分期的基礎上，結合檢測Sp1 的表達可提高對卵巢漿液性囊腺癌患者預后判斷的準確性。

KLF8 位于人類X 染色體，包含359個氨基酸殘基。主要通過激活或抑制富含GC盒的啟動子調控基因的表達，廣泛參與細胞增殖、分化及凋亡。本研究結果顯示，在50 例卵巢癌漿液性囊腺癌標本中，KLF8 呈高表達(陽性率達64.0%)；KLF8在正常卵巢組織中不表達；在卵巢良性上皮性腫瘤的表達率很低。鑒于KLF8表達在卵巢良、惡性腫瘤之間的差異顯著，提示KLF8可能參與了卵巢漿液性囊腺癌的發生發展過程。同時分析發現，KLF8的陽性表達率與患者的臨床病理特征包括病理分級、年齡、淋巴結是否轉移及臨床分期等病理特征間無相關性(P＞0.05)。Cyclin D1 基因位于染色體11q13，在細胞周期G1至S期發揮調控作用，促進細胞增殖，致癌因素可導致Cyclin D1過表達，引起癌變[5]，本研究結果顯示，漿液性交界性腫瘤組織中Cyclin D1 蛋白的陽性表達率明顯高于卵巢漿液性癌，差異有統計學意義(P＜0.01)，低級別漿液性癌組織中Cyclin D1的陽性表達率雖高于高級別漿液性癌，但兩者比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。雖然本組的病例數有限，但仍可以看出低級別漿液性癌和漿液性交界性腫瘤可能具有相同的致病途徑。卵巢高級別漿液性癌與低級別漿液性癌的發病機制不同，而交界性漿液性腫瘤與低級別漿液性癌的關系可能更為密切，這也是有關卵巢癌發病機制中比較新的觀點[6]。Cyclin D1 的陽性表達率與患者的臨床病理特征包括患者的年齡、病理分級及臨床分期等病理特征間無相關性(P＞0.05)。Cyclin D1 陽性表達率在無盆腔淋巴結轉移的漿液性卵巢癌組織中明顯高于有盆腔淋巴結轉移者，但差異無統計學意義(P＞0.05)。多腫瘤抑制基因(MTS1)亦稱P16 基因，P16 蛋白是細胞周期素依賴性激酶(CDK4)的抑制因子。本研究進一步證實，P16在卵巢交界性漿液性囊腺瘤及漿液性囊腺瘤中呈高表達，而在卵巢漿液性囊腺癌中呈低表達，僅為18.0%，差異有統計學意義(P＜0.05)，說明在卵巢癌發展過程中P16 活性下降，刺激細胞分裂，從而使細胞失去控制，趨于惡性化。P16 在Ⅲ～Ⅳ卵巢漿液性癌中的表達低于Ⅰ～Ⅱ；在有淋巴結轉移的癌中低于無淋巴結轉移的癌，統計結果顯示，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示P16 作為卵巢漿液性囊腺癌的診斷指標和預后具有一定價值。