siRNA干擾DNALI1基因對HEK-293細胞增殖與遷移的影響

崔勇 劉功振

摘要：文章探討了siRNA干擾DNALI1基因對HEK-293細胞增殖、遷移的影響。通過培養HEK-293細胞株，分別轉染siRNA DNALI1組（DNALI1-homo-66組、DNALI1-homo-426組與DNALI1-homo-777組）和對照組。siRNA DNALI1組細胞中DNALI1 mRNA表達量均低于對照組，三個干擾組中DNALI1-homo-66組干擾效率最高，差異均具有統計學意義（P<0.05）;與陽性對照組和陰性對照組相比，siRNA DNALI1組細胞轉染24—48h細胞增殖能力明顯減弱，差異均具有統計學意義（P<0.05）。在細胞水平可通過RNA干擾特異性抑制DNALI1基因來抑制細胞的增殖和遷移能力，為研究DNALI1基因在細胞中的作用機制奠定了基礎。

關鍵詞：DNALI1;RNAi;Real-Time PCR;增殖;侵襲

中圖分類號：G642.0? ? ?文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1674-9324（2019）50-0061-02

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指內源性或外源性雙鏈RNA（double strands RNA，dsRNA）與細胞內的同源序列mRNA相結合并使之降解的現象，是一種序列特異轉錄后的基因沉默機制，其作用相當于基因敲除[1-3]。與傳統的基因敲除技術相比，RNAi以其高特異性、高效性、操作簡單等顯著優勢成為研究基因功能的全新手段，其在基因組研究、毒病性疾病治療、腫瘤治療、自身免疫性疾病治療及生物醫藥開發領域有著廣闊的應用前景。本研究通過構建針對DALI1基因的shRNA干擾表達載體，研究DNALI1基因干擾后對HEK-293細胞分裂增殖、遷移的影響。

一、實驗方法

1.細胞培養和轉染。轉染前一天，將4-5×104細胞接種在24孔板上，加入0.5ml含FBS和抗生素，等細胞達到轉染密度加入siRNA及lipofectamin2000（invitrogen）試劑柔和混勻，室溫放置5min，形成siRNA/lipofectamin2000復合物。將100μl復合物加到含有細胞培養基的24孔板上來回輕柔搖晃。在CO2培養箱中以37℃溫育24—48h后，進行轉染后的其他檢測步驟。

2.熒光定量PCR檢測。提取RNA并進行反轉錄，根據操作將提取好的RNA，根據反轉錄反應體系配制混合液，充分混勻，42℃，孵育15min;95℃，孵育3min之后放于低溫保存，然后建立Real-Time PCR反應體系，反應條件如下：預變性95℃，15min;變性95℃，10sec;退火延伸60℃，30sec，共40個循環。從GenBank上獲得DNALI1基因序列，按照shRNA設計原則，針對DNALI1基因序列保守區域各篩選設計、合成3條干擾靶序列，分別命名為DNALI1-homo-66、DNALI1-homo-426、DNALI1-homo-777，同時設計各個對照組（si-NC）、（si-FAM）及（si-GAPDH）。

3.CCK8法檢測細胞增殖實驗。取轉染完畢的細胞，在96孔板中加100μl含3×103個靶細胞懸液，在37℃5%CO2的培養箱培養1—7天，每孔加10μl CCK8染液培養2h;用酶標儀檢測450nm波長下每孔的吸光度值;以吸光度值對時間作圖，繪制細胞增殖曲線。

4.Transwell小室檢測細胞遷移試驗。選擇siRNA有效干擾靶點DNALI1的siRNA-66細胞和對照組細胞進行培養，取對數期的轉染siRNA的細胞，常規消化、離心棄上清，加無血清培養基重懸細胞，制備單細胞懸液，密度調整為5×105個細胞/ml。向每個上室中加200μl細胞懸液（含1×105個細胞），沿著下室內壁加700μl 10% FBS DMEM 700ul。細胞培養箱中孵育16h。取出Transwell小室，甲醇中固定15min，PBS洗3次，放入0.2%的結晶紫染液染色20min，PBS洗3次，顯微鏡下觀察拍照。

二、結果

1.不同組別干擾效率比較。轉染細胞24h后，siRNA DNALI1組細胞中DNALI1 mRNA表達量均低于對照組，三個干擾組中DNALI1-homo-66組干擾效率最高，差異均具有統計學意義（P<0.05）;試驗結果發現DNALI1-siRNA-66在24h干擾效果最好。轉染細胞48h后，DNALI1-homo-66組仍然保持最高干擾效率，差異均具有統計學意義（P<0.05）;試驗結果發現DNALI1-siRNA-66在48h干擾效果最好。

2.不同轉染組細胞侵襲能力情況比較。通過Transwell試驗研究干擾細胞后運動能力的變化，與對照組相比，RNAi DNALI1細胞株運動能力減弱。siRNA DNALI1組細胞遷移細胞數和侵襲細胞數均低于陽性對照組和陰性對照組，差異均具有統計學意義（P<0.05）（見下圖）。

三、討論

軸絲動力蛋白（Axonemal dynein light intermediate polypeptide 1，DNALI1）是纖毛或鞭毛中組成外周二聯絲側臂的蛋白質，是外周二聯絲相互滑動的動力來源。基因敲除軸絲動力蛋白能導致失去纖毛動力，引起男性不育癥和大腦側化缺陷。DNALI1基因定位在4號染色體，包括6個外顯子，其在睪丸組織內大量高效表達，集中在精子細胞和精母細胞，而在其他組織中低水平表達。作為一個軸絲動力蛋白，DNALI1主要定位在氣管纖毛部位和精子，鞭毛部位提供相互滑動的動力來源[4]。

本研究通過培養HEK-293細胞株，分別轉染siRNA DNALI1組和對照組，實時熒光定量PCR技術檢測各轉染組細胞中DNALI1的基因表達，siRNA DNALI1組細胞中DNALI1 mRNA表達量均低于對照組，三個干擾組中DNALI1-homo-66組干擾效率最高，差異均具有統計學意義（P<0.05），而且siRNA DNALI1組在細胞轉染24—48h細胞增殖能力明顯減弱，差異均具有統計學意義（P<0.05）;Transwell小室檢測細胞遷移能力，結果發現siRNA DNALI1組遷移細胞數均低于對照組，差異均具有統計學意義（P<0.05）。因此，在細胞水平可以通過RNA干擾特異性抑制DNALI1基因來抑制細胞的增殖和侵襲力，為研究DNALI1基因在細胞增殖和遷移的作用機制奠定基礎。

參考文獻：

[1]SINHA SK.RNAi induced gene silencing in crop improvement[J].Physiol Mol Biol Plants，2010，16（4）：321-332.

[2]ELBASHIR SM，HARBORTH J，LENDECKEL W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J].Nature，2001，411（6836）：494-498.

[3]IBA？觡EZ-TALLON I，GOROKHOVA S，et al.Loss of function of axonemal dynein Mdnah5 causes primary ciliary dyskinesia and hydrocephalus[J].Hum Mol Genet，2002，（11）：715-721.

[4]RASHID S，BRECKLE R，HUPE M，et al.The murine Dnali1 gene encodes a flagellar protein that interacts with the cytoplasmic dynein heavy chain 1[J].Mol Reprod Dev，2006，（73）：784-794.