動脈粥樣硬化相關miRNAs的概述

田嘉珉 徐將 盧瑤瑤 梁景巖

225000揚州大學醫學院，江蘇揚州

得益于中國經濟的不斷發展，人們的生活質量不斷提高，但同時心腦血管疾病、惡性腫瘤、糖尿病等慢性疾病對人們生命健康造成了日趨嚴重的威脅，在老齡化的社會結構下，心腦血管疾病的發病率更不容忽視。動脈粥樣硬化是一種復雜的炎癥性血管病變，導致了心血管疾病的發生發展[1]。它的發病機制主要有內皮細胞功能受損、脂質在內膜沉積、平滑肌細胞異常增殖等多種要素共同構成。動脈粥樣硬化的臨床表現根據受影響動脈的不同而顯示出一定的特異性，如主動脈粥樣硬化可以引發主動脈瘤；冠狀動脈硬化可導致冠狀動脈粥樣硬化性心臟病；腦動脈粥樣硬化易造成腦栓塞、血管性癡呆；腎動脈粥樣硬化的患者有一定的概率會出現頑固性高血壓；下肢動脈受累引起的皮膚溫度下降、感覺麻痹和間歇性跛行亦屬常見。動脈粥樣硬化有血脂異常、高血壓、抽煙、糖尿病和糖耐量異常等多種危險因素，其中最為主要的病因是脂質代謝失衡。當內皮細胞功能處于異常狀態時，該處的血管壁不再是血漿與外界之間的阻隔，大分子物質如低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等可以自由穿過內皮細胞之間的縫隙，在管壁的最內層聚集，其氧化后產生的ox-LDL-C對于內皮細胞而言也是一種損傷因子；泡沫細胞在脂質條紋中清晰可見，是單核細胞等吞噬ox-LDL-C后形成的一種特殊形態；生理情況下位于中膜的平滑肌細胞受各種生長因子的影響遷徙至內膜，由收縮型向增殖型轉化，肌纖維數量減少，大量分泌細胞外基質；進入內膜的T 細胞等分泌各種促炎介質，包括腫瘤壞死因子、白介素、干擾素等，促進血管炎癥的產生[2]。纖維粥樣斑塊在以上多種機制的共同作用下逐漸形成。對于粥樣硬化斑塊是如何形成的，學術界一直眾說紛紜，無論是脂質浸潤學說，還是內皮損傷后產生應激，抑或是血小板聚集和血栓形成假說、平滑肌細胞克隆學說等，闡述的角度各異，但是對于不同機制之間是怎樣相互作用和調節的，我們尚不明確，最近十幾年中出現在我們關注范圍內的微小核糖核酸(micRNA)為進一步探索動脈粥樣硬化的發病機制開創了新的角度。多項研究表明，miRNA 在轉錄后水平調控基因表達，從而在血脂代謝、腫瘤細胞分化、血細胞生成調節等方面發揮重要調控作用[3-5]。miRNA 是一類內源性的，高度保守的非編碼單鏈RNA，普遍存在于動、植物體內，長度為17～24 個核苷酸長度[6]。其通過結合于靶mRNA 的3'UTR，導致mRNA被直接抑制或者翻譯過程受阻。miRNA 作為調節控制體內各種生理過程的“主力軍”，能夠影響血脂代謝、血管內皮功能等多個環節，在動脈粥樣硬化的病理過程中起著不同的作用。

miRNA簡介

miRNA 的歷史最早可以追溯到1993年，由Lee RC 等人在研究線蟲時發現[7]，許多研究團隊在果蠅、線蟲和人體中發現了數百個miRNAs。到目前為止，我們在動植物及病毒中已經發現了28 645 個miRNA分子。

在真核細胞生物中，成熟的miRNA是由多種核糖核酸酶處理pri-miRNA 后形 成的[8]，miRNAs 通過RNA 誘導沉默復合體接近mRNA 并依據Watson-Crick 堿基配對原則與靶mRNA 分子的3'UTR 相互結合并產生作用，從而起到影響體內各種細胞的分化、發育、增殖的作用，miRNAs 也能調節細胞的凋亡過程[9]。miRNA 與靶mRNA 的互補程度決定了miRNA 的作用方向，假如兩者完全互補，則可誘發靶mRNA 被直接降解，即所謂的RNA 干擾，若miRNA 只與靶mRNA 的一部分形成互補關系，它只能阻斷這一部分靶mRNA 上的信息向肽鏈的合成過程。

參與動脈粥樣硬化病理過程的miRNAs

miRNAs 調節脂代謝：2003年，Xu等發現敲除或抑制miRNA-14的表達使果蠅的甘油三酯和甘油二酯含量增高[10]，相應的，如果增加其miR-14的表達，果蠅的血脂水平恢復正常，這一發現首次肯定了miRNA 在血脂代謝中的調節作用，并由此走上了研究miRNA 與血脂代謝關系的新征程。近幾年間，miRNA-27、miRNA-33、miRNA-122、miRNA-126、miRNA-155 等的調節血脂作用陸續出現。miRNA-122是肝臟中所占比重最大的miRNA，在肝臟內所有miRNA 中大約占70%[11]，其調脂作用是依靠對肝臟內膽固醇的合成和極低密度脂蛋白的分泌調節完成的。Lanford 等人研究發現，低表達miRNA-122 可以降低HMG-CoA 等膽固醇合成相關酶的含量[12]，從而限制膽固醇的合成速率，另有團隊證明抑制miRNA-122 表達后，血漿內總膽固醇、LDL、ApoA1 及ApoB 的水平均下降[13]。細胞內的膽固醇被ApoA1 和ATP 結合盒轉運體A1(ABCA1)吸引并再次合成為成熟的HDL 顆粒，從外周轉運回肝臟，在肝臟內完成向膽汁酸的轉化或直接隨膽汁排泌，稱之為膽固醇的逆向轉運，也被認為是人體中降低血脂水平的重要環節。miRNA-33a、miRNA-33b、miRNA-19b、miRNA-144-3p 下 調 組 織內ABCA1 的活性和表達水平，抑制膽固醇的流出和高密度脂蛋白(HDL)的形成，削弱血漿內HDL轉運膽固醇的能力，并增加低密度脂蛋白(LDL)的含量[14]。miRNAs通過調節脂肪細胞內信號蛋白和轉錄因子等，影響脂肪細胞的分化[15]。Ling等人在研究中發現[16]，小鼠胚胎中分離出的3T3-L1前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化的過程中，miRNA-375 高表達，使細胞內信號轉導通路的信使蛋白表達增多，促進脂質積聚，高水平的miRNA-375 也可以磷酸化細胞外信號調節激酶(ERK)，有利于脂肪細胞的分化。過表達miRNA-363 通過阻滯轉錄因子E2F，使細胞周期無法進入S 期，miRNA-363 抑制脂肪細胞分化的另外一種途徑是抑制細胞內的信使蛋白[17]。3T3-L1 前脂肪細胞的成脂分化過程中，用miRNA 芯片分析可以顯示出表達下調最為明顯的是miRNA-24，脂肪相關性miRNA 轉染前脂肪細胞后發現，miRNA-24 可以通過直接抑制AFABP 蛋白來抑制脂肪細胞的分化和成熟[18]。

miRNAs調節血管內皮細胞功能：盡管存在對動脈粥樣硬化機制的諸多探討，但內皮損傷和內皮細胞功能紊亂長期以來被公認為是動脈粥樣硬化發生的先決條件。內皮細胞是一種扁平的鱗狀上皮細胞，單層覆蓋于血管內側，阻礙血管外大分子物質進入血液，同時具備一定的內分泌功能。當血管內皮的完整性遭到破壞時，一些大分子物質如LDL就可以透過內皮進入血管，啟動動脈粥樣硬化的病理改變；內皮細胞可以分泌許多血管活性因子，如NO、內皮素等，生理情況下，血管活性因子之間維持平衡，能有效地調節血管張力、防止血栓的構成。Zhang 等將高表達miRNA-24 的質粒引入人臍靜脈內皮細胞中，發現內皮細胞增殖明顯下降，胞內內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和特異性蛋白1(Sp1)的含量均顯著減少，由此推斷內皮細胞增殖和eNOS合成受miRNA-24抑制，NO的合成和釋放減少，血管舒張功能被破壞[19]。此外 ，miRNA-155、miRNA-222/221、miRNA-24 等miRNAs 過表達也會抑制eNOS 的表達[20-22]。動脈粥樣硬化是一種在多種炎癥介質相互影響下形成的病變。Chen 等在ox-LDL 刺激的單核/巨噬細胞中找到了變化最為明顯的miRNA-125a-5p[23]，并通過使用相應抑制劑證實miRNA-125a-5p可以降低單核/巨噬細胞對脂質的吞噬，另一方面還能顯著增加TGF-β、IL-2等細胞炎性因子的分泌。該項目組的研究還證實miRNA-125a-5p的靶基因就是ORP9，抗miRNA-125a-5p 轉染的細胞中ORP9 蛋白顯著高于正常細胞，表明miRNA-125a-5p 抑制了ORP9 蛋白的表達。張紅娜用oxLDL 刺激人臍靜脈內皮細胞測得細胞內miRNA-142-3p 含量顯著高于正常細胞[24]，且呈現出一定的時間依賴性，而在相同時間間隔內測定的正常細胞中miRNA-142-3p 含量沒有顯著性差異。韓沛然的研究表明miRNA-365 過表達對內皮細胞的凋亡起到了促進作用[25]。高脂血癥患者的miRNA-365 的表達水平明顯高于正常個體，且與血脂水平有一定關系；在一個周期的調脂藥物規范化治療后，患者的血漿膽固醇減少，miRNA-365 表達水平也出現了明顯下降，兩者的減少程度呈現出一定的正相關性。這一結果可能表明，當人體無法將血脂保持在正常范疇內，LDL在血管壁內膜下聚積時，ox-LDL加重了內皮細胞的損害，miRNA-365 通過諸如凋亡小體一類的轉運體從內皮細胞中釋放到血漿中，可以檢測到的miRNA-365 表達水平因此升高。黎健的研究表明miRNA-34a 通過SIRT1-FoxO1信號通路介導內皮細胞衰老和新生血管形成[26]。在已知老年小鼠心肌和脾臟中miRNA-34a 表達較年輕小鼠有明顯增高的基礎上，他的實驗證明高表達miRNA-34a 的內皮祖細胞的衰老細胞比例增加，血管新生能力明顯減弱，過表達miRNA-34a 或者阻礙SIRT1-FoxO1 信號通路都能介導內皮細胞的老化，減少新生血管形成。進一步研究表明，miRNA-34a 的表達水平對SIRT1 的影響與年齡有一定關系，過表達miRNA-34a老年小鼠內皮祖細胞中SIRT1 表達水平增加，而年輕小鼠的表現正好相反，因此，miRNA-34a 與血管內皮細胞衰老和新生血管形成之間的關系還有待進一步探查。miRNA-129-1 和miRNA-133 直接靶向血管內皮生長因子并抑制其表達，miRNA-107 則通過影響血管內皮生長因子的信號通路，間接促進新生血管的形成[27]。翁春華等人的研究表明[28]，miRNA-196、miRNA-296、miRNA-409-3p、miRNA-641可以直接結合血管生成素的3'UTR，通過抑制血管內皮的細胞增殖或管腔形成而抑制血管增生。戴運等人發現miRNA-372 靶向抑制血管生成因子AGGF1 基因并抑制新生血管[29]。

miRNAs影響血管平滑肌功能：位于血管壁中層的平滑肌細胞大多為收縮型，通過肌纖維的收縮來改變管腔的大小、調節血管的血流。在動脈粥樣硬化的病程中，泡沫細胞合成并分泌血小板源生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1 等物質，平滑肌細胞受PDGF、FGF 的影響遷徙至內膜并增殖，一部分細胞分化為巨噬細胞，攝取oxLDL-C，另一部分則發生顯著增殖，合成和分泌斑塊纖維帽中的常見基質成分，粥樣斑塊的形成致使管腔直徑變小，一旦纖維帽發生破潰，它可能會引起心血管常見急癥的發生，如不穩定性心絞痛和心肌梗死。平滑肌細胞的異常增殖被認為是動脈粥樣硬化、冠心病和再狹窄的治療靶點之一，目前已經發現多個miRNA 參與了平滑肌細胞分型轉換和凋亡過程的調控。研究發現，在球囊損傷頸動脈動物模型中，miRNA-146a 顯著高表達[30]，且miRNA-146a 可能與動脈粥樣硬化的發生有關[31]。在熊瑋的研究中發現[32]，miRNA-146a的表達水平在血管平滑肌細胞(VSMC)的增殖過程中顯著增加，而加入anti-miRNA-146a 的平滑肌細胞凋亡比率上升，證明miRNA-146a 能促進平滑肌細胞的增殖，p53信號通路中的細胞周期蛋白cyclinD1 是其作用的關鍵點，cyclinD1的基因和蛋白表達水平上調，促進了VSMC 從G1 期向S 期的轉化，使平滑肌細胞發生異常增殖，凋亡減少。PDGF在平滑肌細胞從中膜向內膜的遷移過程之中，起到了相對主要的調節作用。徐宏鑫發現[33]，Anti-miRNA-92a 能夠明顯抑制人主動脈平滑肌細胞在PDGF刺激下的偽足伸出數量，抑制平滑肌細胞的遷移，而miRNA-92a 可以作為哺乳動物轉錄因子4(KLF4)的抑制劑，使KLF4表達減少，平滑肌細胞的增殖和遷移增強。進一步研究表明，Rho 激酶通過miRNA-92a調控KLF4，促進血管平滑肌細胞的類型轉換[34]。除此以外，多項研究表明過表達 miRNA-29a[35]、miRNA-31、miRNA-424/322 均可促進平滑肌細胞的增殖和遷移[36]，而miRNA-133、miRNA-365、miRNA-663等抑制這一現象[37]。

人們飲食習慣的改變和生活水平的不斷提高，帶來了不容忽視的問題，心腦血管疾病的患病率逐年增加，患病的初始年齡也日趨減小，從長遠來看，它將對所有人的健康和社會的發展產生一定的不利影響。作為循環系統疾病中的一種常見慢性病，粥樣斑塊的形成甚至可以從兒童期開始，目前的治療方法主要是早期注意危險因素，防范動脈硬化的發生，合理調整營養結構，適度開展鍛煉活動，主動戒煙，限制酒精攝入量等；若是已經出現了粥樣斑塊，就需要積極開展藥物和手術治療，用藥方案主要以調整血脂、防止血小板積聚、減少血栓形成、改善心肌預后為多見，但是還沒有確切有效的方法阻斷粥樣硬化斑塊的形成。miRNAs的出現為我們探究動脈粥樣硬化的發病機制和研發靶向治療方法提供了新的思路。越來越多的研究證明，miRNAs能調控血脂代謝、內皮細胞功能調節、血管平滑肌細胞的分化增殖、血管炎癥等，涉及動脈粥樣硬化的多個方面。然而，關于miRNAs還有許多未解之謎，更多與動脈粥樣硬化相關的miRNAs 的作用機制是怎樣的，miRNAs之間存在怎樣的相互調控網絡，能否通過過表達或抑制某一種或幾種miRNA 阻斷信號通路，抑制或減緩粥樣硬化斑塊的產生，這些問題都將是我們下一步的研究目標。