蟲草素抗腎纖維化研究進展

代麗娟，宋立群，贠捷，張德欣，于思明，馬艷春

(1.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院)

腎纖維化是慢性腎臟病(CKD)進展至終末期腎臟病(ESRD)的重要因素[1]。目前CKD的發病率逐年上升，為9%～13%[2],若進展至ESRD，患者需行腎臟替代治療,導致社會和個人經濟負擔沉重。腎纖維化包括三個方面：腎間質纖維化、腎小球硬化、腎血管纖維化。其主要的病理特征為進行性細胞外基質(ECM)堆積。形成腎纖維化的病理機制與多種環節密切相關，如炎性反應、腎臟固有細胞及免疫細胞凋亡、氧化應激、生長因子、細胞因子失衡等[3-6]。西醫學抗腎纖維化的研究主要通過建立腎纖維化的動物模型及誘導體外細胞培養，目前仍處于臨床實驗階段，主要應用血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、肝細胞生長因子、抗TGF-β抗體、吡非尼酮、舒拉明等藥物治療，臨床研究尚不盡成熟，臨床療效亦不十分理想。而中醫學注重整體觀念，辨證論治，中醫藥治療在延緩腎纖維化進程的臨床應用中取得一定的療效。大量研究證實，單味中藥及中藥提取物可從多個環節發揮作用，從而防治腎纖維化，如雷公藤多苷、積雪草苷、黃芩素、五味子乙素等[7]，揭示了中藥及中藥提取物在抗腎纖維化中發揮的重要作用。本文擬就蟲草素干預多種信號通路防治腎纖維化的臨床研究進展作一綜述。

1 腎纖維化的發病機制

腎纖維化可由多種慢性腎臟病導致，亦是多種因素驅動的病理過程。多種致病因子作用于各相關信號通路，可誘導ECM大量堆積，ECM逐漸增多，腎小球細胞反復受損，腎小管萎縮等，均可促進腎纖維化的發生發展。

1.1 轉化生長因子β(TGF-β) TGF-β是主要的啟動腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化(TEMT)的生長因子[8]。其中以TGF-β1最重要，可激活WNT信號通路和TGF-β/Smad信號通路，啟動腎纖維化病理機制[9-10]。

1.2 上皮間充質轉化(EMT) 約35%的活躍成纖維細胞來源于EMT[11]。腎小管上皮細胞 (TECs)在TGF-β的誘導下，發生 TEMT，可遷移臨近的腎間質與實質。EMT可激活成纖維細胞，增加纖維連接結蛋白(FN)和膠原合成，使ECM大量堆積[12]。

1.3 細胞外基質(ECM) ECM廣泛存在于腎間質中成纖維細胞、腎小管上皮細胞、血管內皮細胞中，并在其中合成分泌[13]。通過激活基質金屬蛋白酶(MMPs)系統，抑制使MMPs表達降低或活性下降，可引起ECM降解減少，從而造成ECM異常沉積。越多的ECM聚集到腎小球系膜區，則更加重腎小球硬化[14]。

1.4 其他細胞因子 包括內皮素-1(ET-1) 、鋅指轉錄因子(Snail)、骨形成蛋白-7(BMP-7)、肝細胞生長因子(HGF)、T細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)、整合素連接激酶(ILK) 、結締組織生長因子(CTGF) 、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1) 、血小板反應蛋白-1(TSP-1) 、腫瘤壞死因子α(TNF-α) 、細胞黏附分子、血管內皮生長因子(VEGF)等，都與腎纖維化的形成密切相關[3]。

2 蟲草素抗腎纖維化

冬蟲夏草，性甘味平，功效在于補肺益腎，益氣填精，以補益腎氣為主。《本草從新》中首次記載了冬蟲夏草“保肺益腎，止血化痰，已勞嗽”。《柑園小識》提到“以酒浸數枚啖之，治腰膝間痛楚，有益腎之功”，強調其益腎之功。慢性腎臟病患者多以本虛標實為主，本虛多為腎虛，臨床中應用冬蟲夏草及其中成藥制劑治療慢性腎臟病，亦取得較好療效。蟲草素又稱為蟲草菌素，蛹蟲草菌素，為中藥冬蟲夏草中提取出的活性有效成分，其化學名為3,-脫氧腺苷，為一種核苷類抗生素,分子式為C10H13N5O3，相對分子量為251[15]。現代藥理學研究表明，蟲草素具有抑制腎間質中成纖維細胞、腎小管上皮細胞、血管內皮細胞纖維化的作用，可減輕炎性細胞浸潤、抑制腎小球系膜區、腎間質ECM聚集及免疫復合物沉積，因此可保護腎組織[16-17]。

2.1 蟲草素調控TGF-β/Smad信號通路 在TGF-β/Smad信號通路中，TGF-β作為促纖維化因子可與相應受體結合，并啟動TGF-β/Smad信號通路誘導Smad2/3磷酸化，形成p-Smad2/3。p-Smad2/3與Smad4結合向細胞核內轉移，誘導多種促纖維化因子靶基因轉錄和翻譯，形成或加重腎纖維化。ILK[18]是一種存在于細胞內的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為連接細胞與細胞外基質兩者間的重要分子成分，故可調節ECM聚集。ILK亦是TGF-β/Smad信號通路中生物效應的下游分子,可參與FN的合成及EMT的過程。顧劉寶等[19]研究表明，蟲草素抗腎纖維化作用與抑制TGF-β/Smad信號通路有關，其主要作用靶點是降低Smad磷酸化水平，而非干預Smad蛋白合成。蟲草素能夠有效抑制Smad2/3 蛋白磷酸化，減少下游I型、IV型膠原蛋白表達，梁澤智等[20]采用高糖誘導NRK-49F細胞發生腎小管間質化(EMT)，研究表明蟲草素對α-SMA mRNA及蛋白水平、TGF-β有明顯抑制作用，同時上調E-cadherin mRNA翻譯及蛋白合成，因而拮抗處理的NRK-49F細胞轉分化，抑制EMT。還有研究表明，蟲草素可通過抑制HGF表達，抑制TGF-β、α-SMA及蛋白，從而抑制TGF-β/Smad信號通路、下調FN的表達，調節腎間質肌成纖維細胞，產生抗纖維化的作用[21]。Mc Gonigle等[22]發現，eIF2α作為TGF-β及其信號通路的上游因子，磷酸化后可調控其信號傳導過程。蟲草素促進eIF2α磷酸化，與TGF-β受體結合，使翻譯受阻，影響下游信號傳導，最終阻斷Smad信號通路，緩解腎纖維化。因此，蟲草素可通過介導TGF-β、eIF2α、Smad2/3蛋白、HGF、α-SMA及蛋白，抑制eIF2α/TGF-β/Smad 信號通路的傳導，達到抗腎臟纖維化的作用。

2.2 蟲草素調控TGF-β/Snail信號通路 在TGF-β/Snail信號通路中，激活鋅指轉錄因子(Snail) 使腎小管上皮細胞EMT聚積，而TGF-β和氧化應激等是Snail信號通路激活的重要因素。蟲草素能有效抑制高糖導致的TGF-β表達上調和腎小管上皮細胞EMT。Snail是E- caherin 轉錄中重要抑制基因，通過抑制 E-caherin 的表達，下調緊密連接蛋白(Clau- dins) 、閉合蛋白(Occludins)及附膜蛋白(Muc1)等表面蛋白，激活FN及基質金屬蛋白-9(MMP-9)的表達，最終誘導EMT。陳結慧等研究結果顯示，蟲草菌液可下調TGF-β1、α-SMA表達及Snail1信號蛋白表達，并且激活E-cadherin，使膠原纖維沉積減少。這表明蟲草制劑中有效成分可通過抑制TGF-β1/Snail1 信號通路的傳導而抑制糖尿病小鼠EMT[23]。

2.3 蟲草素調控PI3K/Akt/mTOR信號通路 在mTOR信號通路中，mTOR是連接細胞與細胞外基質的絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶，mTOR信號通路參與腎臟疾病的發病機制[24]。有人[25]應用UUO模型研究，四甲基哌啶氮氧化物(Tempol) 抗氧化劑可抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的傳導，對腎臟起到保護作用，防治腎纖維化。Ma等[26]研究表明，在腎纖維化模型中PI3K、Akt與mTOR蛋白磷酸化水平明顯升高，PI3K/Akt/mTOR信號通路激活。高血糖可誘導糖尿病患者上調Akt，激活Akt/mTOR信號通路，促使ECM聚集，抑制單磷酸腺苷活化蛋白激酶 (AMPK)，此為引起腎小球肥大、基底膜增厚、足細胞損傷的病理機制之一，并導致腎功能損傷[27]。蟲草素可通過阻斷IκBα降解，抑制Akt和p38激酶的磷酸化，抑制NF-κB活性，抑制炎性因子NO、PGE2。在PI3K/Akt/mTOR 信號通路中，蟲草素通過抑制Akt來抑制信號傳導，達到抗腎纖維化的作用[28]。

2.4 蟲草素調控AMPK/mTOR信號通路 AMPK/mTOR信號通路是調控細胞自噬的重要途徑。細胞自噬通過參與細胞生長，增殖和凋亡相關的多種信號傳導過程，誘導腎小管上皮細胞的損傷和凋亡。自噬激活依靠的主要細胞學標志為LC3，LC3是位于前自噬泡和自噬泡膜表面的自噬激活調控因子，是通過AMPK/mTOR信號通路來參與腎纖維化的進程。LC3主要有LC3-I和LC3-Ⅱ兩種亞型，細胞自噬泡膜多由LC3-Ⅱ標記。AMPK作為細胞的能量識別受體，可識別機體能量調節變化，mTOR激酶參與AMPK/mTOR信號傳導，也是調節細胞自噬的關鍵信號分子，受到營養剝奪、胰島素和其他生長因子的影響，細胞處于饑餓狀態可觸發該自噬途徑。活化的AMPK負調節mTOR，當細胞營養缺乏時，PI3K/AMP依賴的AMPK信號通路激活，最終激活mTOR，抑制細胞自噬的啟動[29]。徐喆等[30]應用鏈脲佐菌素腹腔內注射復制糖尿病腎病(DN)大鼠模型，其研究表明冬蟲夏草提取物可通過激活AMPK/mTOR信號通路的傳導，下調標記蛋白LC-3II的含量，有效抑制腎小管細胞自噬啟動，減緩腎小管細胞的損傷。

2.5 蟲草素調控p38MAPK信號通路 p38MAPK信號通路參與腎小球系膜細胞損傷的形成，通過激活磷酸化p38MAPK，刺激p38MAPK信號通路傳導，在分子水平上加快腎間質纖維化進程。基因 megsin表達后可加重系膜細胞增殖和(或)腎小球系膜基質擴張伴腎間質損傷，在腎纖維化中起關鍵作用。宋立群等[31]研究表明，高糖誘導的人腎小球系膜細胞(HMC)內p38MAPK、megsin mRNA表達升高，與高糖組比較，蟲草益腎顆粒劑量組p38MAPK、megsin mRNA表達下調。據此可推測蟲草素可通過抑制高糖誘導的HMC中p38MAPK、 p-p38MAPK，抑制p38MAPK信號通路的傳導、抑制megsin mRNA的表達、megsin 的合成和分泌，起到延緩腎纖維化進展的作用。

2.6 蟲草素調控Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin信號通路可在多種糖尿病腎病動物模型介導腎臟纖維化。Wnt蛋白、受體Frizzled、共受體LRP5結合成三聚體，可抑制細胞質中β-catenin磷酸化、防止β-catenin降解，影響Wnt/β-catenin信號通路的傳導。在細胞核中β-catenin與 T細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)相互作用，對c-myc、cyclinD1、VEGF、FN、FGF等基因轉錄翻譯具有重要調控作用[32]。DKK1是 Wnt 信號通路的重要內源抑制劑，與LRP5/6、穿膜蛋白kremen1/2三者結合，激活 Wnt信號下游 Twist、LEF1、c-myc、纖連蛋白的表達，形成或促進腎纖維化[33-34]。有研究[35]發現，DKK1通過介導高糖誘導 β-catenin 磷酸化和減少β-catenin 水平，促進促纖維化因子包括TGF-β/FN的表達。應用 DKK1-AS能抑制糖尿病大鼠尿蛋白的排泄及抗腎臟系膜細胞纖維化。研究發現冬蟲夏草有效成分可抑制糖尿病大鼠模型β-catenin蛋白的分解、DKK1mRNA 及蛋白表達，介導Wnt/β-catenin，具有非依賴降糖的腎臟保護作用。故DKK1是冬蟲夏草有效成分在抗腎纖維化的重要作用靶點[36-37]。

2.7 蟲草素調控PPARγ/RARs信號通路 過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是一種細胞核受體，由三種亞型PPARα、PPARβ、PPARγ組成。PPARγ受體和RARs受體結合形成二聚體后參與多種細胞生理過程，和多種腎臟疾病的發展相關。PPARγ激動劑羅格列酮能明顯降低糖尿病大鼠腎小球和腎間質病變[38]，降低IgA腎病大鼠腎臟組織PCNA、TGF-β1、ATR1、ICAM-1的表達，減輕腎臟病變[39-40]。PPARγ激活后能明顯抑制腎小球系膜細胞分泌α-SMA和Col-Ⅳ[41]。激活的PPARγ同時抑制腎間質成纖維細胞PI3K/AKT信號通路。血小板源性生長因子(PDGF)可激活PI3K/AKT信號通路活化MMP2，MMP2通過降解非纖維結構樣膠原并裂解彈性蛋白以釋放具有生物活性的ECM，啟動腎間質纖維化的發生，蟲草素屬真菌類新型植物雌激素(PE)，可活化PPARs，調控PPARγ/RARs信號通路，發揮抗腎纖維化的作用[42]。

以上7種信號通路相互關聯，TGF-β作為Smad信號通路和Snail信號通路中重要的致病因子可下調DKK1,同時激活Wnt/β-catenin信號通路。Wnt通路激活時，信號傳導至下游TCF/LEF、c-myc、纖連蛋白，可激活PPARγ/RARs信號通路，形成或促進腎纖維化。在Wnt/β-catenin 信號傳導過程中，可抑制 GSK3-β，又可穩定Smad3 。Smad3可幫助 β- catenin核內轉移，兩種信號相互促進。在PI3K/Akt/mTOR信號通路中，抑制GSK3-β，可調控TSC1/2、TBC1D7，介導AMPK/mTOR信號通路。TGF-β1可上調AKT、 ARK5的磷酸化，激活PI3K/AKT 信號通路，調控轉錄因子Snail的表達，促進Snail核內轉移。PPARγ作用于TGFβ/smad信號通路中阻遏因子c-Ski，阻斷TGFβ/smad信號傳導。激活wnt信號通路可下調PPARγ,及 m R N A 表達,調節細胞增殖。TGF-β1在非Smad通路中可上調 PAI-1的表達，同時可激活p38 MAPK。mTOR可介導AMPK/mTOR和PI3K/Akt/mTOR信號通路。

3 現狀與展望

通過現有相關研究可見蟲草素抗腎纖維化作用機制并不單一。蟲草素可通過抑制HGF表達，抑制TGF-β、促進TGF-β及其信號通路的上游因子eIF2α磷酸化，下調Snail 1 信號蛋白表達，并且激活E-cadherin，阻斷 IкBα降解，抑制 Akt和 p38激酶的磷酸化，抑制 NF-кB活性，抑制炎性因子 NO、PGE2，下調標記蛋白LC-3II的含量以抑制細胞自噬啟動，抑制p38MAPK、 p-p38MAPK，抑制megsin mRNA 的表達、megsin的合成和分泌，抑制DKK1mRNA及蛋白表達活化PPARγ。蟲草素通過作用于多種信號通路抑制腎纖維化，多種信號通路之間協同作用，相互關聯，同時通過多種途徑抑制腎臟纖維化的進程。