整合素α4半胱氨酸突變質粒的構建及谷胱甘肽化水平檢測*

尤媛媛 陳善澤 李東玨 郭婧 黃寧 李婧瑜

(四川大學華西基礎醫學與法醫學院病理生理學教研室，四川 成都 610041)

谷胱甘肽化是一種重要的氧化還原性翻譯后修飾，可導致蛋白可逆的功能性改變[1-3]。在一些細胞中，活性氧的產生推動著蛋白的半胱氨酸殘基上的自由巰基(-SH)與谷胱甘肽(Glutathione,GSH)相互作用形成蛋白-谷胱甘肽混合二硫加和物(Pr-SSG)[4]。S-谷胱甘肽化化影響多種蛋白的功能，包括胞內蛋白actin、titin轉錄因子NF-κB，及胞外組分如整合素α4、細胞因子IL-1β等[5-7]，以此來調節細胞信號和功能。

整合素家族是在許多生命活動中起著重要作用的粘附分子，包括細胞分裂、凋亡、分化、炎癥反應以及組織修復等生理或病理過程[8,9]。其中α4β1/VCAM-1粘附信號在中性粒細胞產生、骨髓釋放、粘附到血管內皮等多個環節起重要作用[10]。我們的前期研究表明α4亞基的谷胱甘肽化可能會調控α4β1/VCAM-1的粘附信號通路。因此深入研究α4亞基的谷胱甘肽化的修飾位點具有重要作用。本文旨在用基因工程技術構建整合素α4的半胱氨酸突變質粒，通過體外檢測谷胱肽化的方法來鑒定其谷胱甘肽化修飾位點，為研究谷胱甘肽化調控α4β1/VCAM-1的粘附信號及其在中性粒細胞骨髓釋放過程中的作用墊定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

293T細胞系由四川大學孫曉東副研究員饋贈，Flag-α4真核表達質粒購自Gene Copoeia。High-Fidelity Master Mix購自Maclab, DMT酶購自Transgen Biotech, DMT chemically Competent Cell購自Transgen Biotech, anti-Flag Agarose Beads購自Abmart, BioGEE購自Thermo Fisher, H2O2購自Sigma, Strepdavidin-HRP購自Cell Signaling Technology, Flag antibody購自Santa Cruz等。

1.2 方法

1.2.1 整合素α4半胱氨酸殘基點突變質粒構建

以野生型Flag-α4質粒為模板，進行PCR擴增；對PCR產物用DMT酶37℃孵育1 h消化；然后轉化到DMT感受態細胞中，涂板37℃過夜培養；挑取長出的單克隆37℃搖菌，存菌并送公司測序鑒定；測序構建成功的，搖菌小提質粒，并用鈣轉染試劑轉染到293T細胞，用Flag抗體Western blot檢測質粒表達情況，選取表達良好的質粒，大提質粒-20℃保種。

1.2.2 免疫共沉淀法獲得整合素α4蛋白

利用鈣轉的方法，向前一天鋪種的10 mm盤的293T細胞中轉染Flag-α4質粒，24 h后加入1 ml細胞裂解液冰浴30 min裂解細胞，收集細胞裂解液到1.5 ml管中，加入anti-Flag瓊脂糖珠，在4℃旋轉混合4 h，用PBS緩沖液洗脫瓊脂糖珠三次，去除非特異性結合，即得到富集的Flag-α4蛋白。

1.2.3 整合素α4谷胱甘肽化檢測

在1.5 ml管中加入富集的Flag-α4蛋白、生物素偶聯的GSH(BioGEE)(提供谷胱甘肽化所需GSH)、H2O2(活性氧的一種，促進修飾發生)室溫處理15 min，并設置不加BioGEE、H2O2處理組，還原劑DTT處理15 min組不可逆去除谷胱甘肽化修飾為對照；然后將樣品做非還原型(上樣緩沖液不加還原劑)SDS-PAGE的Western blot，用Strepdavidin-HRP檢測谷胱甘肽化修飾α4蛋白含量。

2 結果

2.1 整合素α4半胱氨酸殘基點突變質粒構建

2.1.1整合素α4半胱氨酸殘基點突變質粒引物設計

成熟的整合素α4蛋白中共有6個未形成二硫鍵的半胱氨酸，依次分布在81、85、278、717、767和828位[11]。我們設計把這六個位點的半胱氨酸分別突變成天冬氨酸，表1即為六個單氨基酸突變的PCR引物。

表1 整合素α4半胱氨酸突變質粒的PCR引物

2.1.2整合素α4半胱氨酸殘基點突變質粒PCR擴增和酶切

Flag-α4質粒長度約為8.5 kb，PCR產物均有長度與之相符的片段，如圖1A所示；經DMT酶切消化處理模板后，可見消化產物仍有長度與之一致的片段，如圖1B所示。

2.1.3整合素α4半胱氨酸殘基點突變質粒測序驗證

經測序鑒定，六個位點的半胱氨酸殘基均分別突變成了天冬氨酸殘基，如圖2所示，81、85、278位半胱氨酸的密碼子TGT突變成了天冬氨酸的密碼子GAT，717位半胱氨酸的密碼子ACA突變成了天冬氨酸的密碼子ATC，767位半胱氨酸的密碼子GCA突變成了天冬氨酸的密碼子GTC，828位半胱氨酸的密碼子ACA突變成了天冬氨酸的密碼子GTC。

圖1 Flag-α4半胱氨酸突變質粒構建注：A為PCR產物的電泳條帶，B為DMT酶消化后的電脈條帶。

圖2 Flag-α4半胱氨酸突變質粒測序結果注：每個位點左側為野生型測序結果，右側為突變型測序結果。

2.2 整合素α4半胱氨酸殘基點突變質粒在293T細胞中的表達

將構建好的突變質粒和野生型Flag-α4質粒轉染到293T細胞中，用anti-Flag抗體進行Western blot檢測，如圖3所示，轉染了野生型或突變型Flag-α4質粒的細胞裂解液均呈現清晰的Flag-α4的蛋白條帶，分子量約為150 kD，與理論結果一致。

圖3 Flag-α4半胱氨酸突變質粒在293T細胞中的表達

2.3 半胱氨酸殘基點突變整合素α4的體外谷胱甘肽化

如圖4A所示，野生型的整合素α4具有谷胱甘肽化修飾，還原劑DTT會清除這種修飾。為了深入研究其谷胱甘肽化修飾位點，我們用半胱氨酸突變為天冬氨酸的突變型α4進行了體外谷胱甘肽化的檢測。如圖B-G所示，在81、85、278、717、767或828位半胱氨酸殘基突變成天冬氨酸殘基后，仍能檢測到谷胱甘肽化修飾，并且類似的，還原劑處理后修飾消除。

圖4 半胱氨酸突變Flag-α4的體外谷胱甘肽化注：A為野生型Flag-α4，B-G分別為81、85、278、717、767、828位半胱氨酸突變為天冬氨酸的Flag-α4，其處理同A所示。

3 討論

氧化還原反應涉及許多生理性或病理性細胞活動，包括激酶信號通路、膜通道功能、轉錄調控、蛋白折疊等[12,13]。谷胱甘肽化作為一種可逆的氧化還原性修飾，可引起蛋白活化或失活。它不但可以保護蛋白免于氧化壓力下被不可逆氧化，還被逐漸認識到是一種重要的信號通路調控手段。目前大約有幾十種蛋白已被證實在生理條件下受谷胱甘肽化調控。比如，我們之前的研究就表明谷胱甘肽化在中性粒細胞的actin動態調節過程中占據重要的生理地位，從而調控中性粒細胞的功能[14]。

已有多個研究小組報道在酸性粒細胞、黑色素瘤細胞中，谷胱甘肽化通過修飾整合素α4亞基調節α4β1/VCAM-1粘附信號[11,15]；我們的前期研究表明在中性粒細胞中，谷胱甘肽化對該粘附信號起重要的促進作用。進一步分析整合素α4的結構發現整合素α4包含一些獨有的未形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，即本研究中分析的六個位點。有研究表明在K562細胞中，整合素α4的Cys278和Cys717突變抑制了α4β1與VCAM-1的結合[16,17]。因此，鑒定整合素α4的修飾位點，對探究谷胱甘肽化對α4β1/VCAM-1粘附信號及相關的細胞生命過程具有重要意義。

為明確α4中具有谷胱甘肽化修飾的半胱氨酸殘基，本研究構建了一系列單點突變的α4真核表達質粒，免疫沉淀富積突變的整合素α4蛋白，再利用體外谷胱甘肽化方法檢測其谷胱甘肽化水平。結果顯示：單一半胱氨酸位點突變后，仍能檢測到谷胱甘肽化信號；這提示著α4的谷胱甘肽化修飾可能不是針對單一半胱氨酸殘基，而是存在多位點同時修飾。因此我們將在后續的研究中，構建多位點突變質粒，并結合質譜的方法來最終確定整合素α4的谷胱甘肽化修飾位點，繼續深入研究谷胱甘肽化對整合素α4功能的調節作用。