餐飲食品中金黃色葡萄球菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

鄭小嚴(yán)，柯振華，李晨熙

（1 福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350000）

（2 國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（福州）， 福建 福州 350000）

食品中金黃色葡萄球菌快速有效的檢測(cè)體系對(duì)于食品安全至關(guān)重要。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），是革蘭氏陽(yáng)性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重感染[1-2]。被金黃色葡萄球菌腸毒素污染的食品能引起人體惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀[3-7]。

餐飲食品在我國(guó)具有廣泛的消費(fèi)市場(chǎng)，而餐飲食品在加工過(guò)程中容易遭受金黃色葡萄球菌的污染[8-11]，從而帶來(lái)一定的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。從食品安全角度考慮，建立一種快速有效的餐飲食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法具有重大意義。

在我國(guó)，對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)主要依賴于常規(guī)的微生物學(xué)檢測(cè)方法，微生物培養(yǎng)方法步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢測(cè)過(guò)程一般至少需要4天時(shí)間。為適應(yīng)食品安全快速檢測(cè)趨勢(shì)，急需開(kāi)發(fā)一種替代方法。目前在國(guó)際上已有較多PCR技術(shù)應(yīng)用于金黃色葡萄球菌檢測(cè)的研究報(bào)導(dǎo)[12-17]，相關(guān)研究表明，采用PCR方法進(jìn)行樣品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)分析，具有高通量、高特異性、高靈敏度等特點(diǎn)。

為節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率，文中開(kāi)發(fā)了餐飲食品中金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法。通過(guò)試驗(yàn)比較，該方法選用煮沸法提取樣品DNA，采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)試樣中的金黃色葡萄球菌。主要包括使用無(wú)菌采樣、培養(yǎng)基預(yù)增菌、煮沸法提取DNA、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)特異性地檢測(cè)金黃色葡萄球菌四個(gè)步驟。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用該研究方法可快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)出餐飲食品中的可能存在的金黃色葡萄球菌。

1 材料與方法

1.1 材料

（2）餐飲食品，購(gòu)于市場(chǎng)，于4℃冰箱中保存。

（3）試劑：7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基(北京陸橋 )；TaKaRarTaq(5U/μL)、MgCl2(25mmol/L)、dNTPs(10mmol/L)、Qiagen Generation Capture Column Kit。

（4）主要儀器：Bio-Rad核酸蛋白測(cè)定儀，Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)。

1.2 方法

（1）預(yù)增菌：純菌培養(yǎng)所用試驗(yàn)菌株接種于10mL7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h。餐飲食品取25g，加入液體7.5% NaCl肉湯培養(yǎng)基，渦旋震蕩60s，37℃培養(yǎng)18h。

預(yù)增菌后，分別取兩管3mL菌液用于DNA提取。為比較不同DNA提取方法應(yīng)用于金黃色葡萄球菌的提取效果，收集一管菌液采用煮沸法提取DNA，另一管菌液采用試劑盒法提取DNA。

（2）PCR模板的制備方法

煮沸法提取DNA：取細(xì)菌培養(yǎng)液3.0mL，置于小離心管中，8000 r.p.m/min離心5min。棄上清，沉淀用300μL TE緩沖液懸浮，于95℃～98℃煮沸10min，10000r.p.m/min離心10min。取上清，即為DNA模板溶液。

試劑盒法提取DNA：按照Qiagen試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取DNA。

（3）引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)金黃色葡萄球菌基因組保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物信息見(jiàn)表1，引物合成于Invitrogen公司。

表1 引物信息以及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

（4）實(shí)時(shí)熒光 PCR反應(yīng)體系

實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系：在25μL反應(yīng)體系中，10×PCR buffer 2.5μL、MgCl22.5μL、dNTPs 1.0μL、上、下游引物各0.5μL，Taq酶0.3μL，探針0.3μL，模板溶液2.0μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積至25μL。

實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件：94℃變性45s，58℃退火60s，72℃延伸60s，經(jīng)40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃，10min。

（5）靈敏度試驗(yàn)

7.5 % NaCl肉湯增菌培養(yǎng)液DNA提取用菌落平板記數(shù)法定量的菌液，加入5mL液體7.5% NaCl肉湯培養(yǎng)基。于37℃、220 r.p.m/min的搖床中增菌培養(yǎng)10h。吸取增菌液1mL，用煮沸法制備PCR模板。

實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌的敏感性試驗(yàn)用煮沸法提取金黃色葡萄球菌的基因組DNA作為模板溶液，測(cè)定基因組DNA濃度，將其梯度稀釋后進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，繪制各自的擴(kuò)增曲線。

2 結(jié)果與分析

（1）餐飲食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增效果良好。引物與探針的退火溫度基本一致，擴(kuò)增效率較高，結(jié)果見(jiàn)圖1。該研究一共抽樣檢驗(yàn)了37份餐飲食品，其中7份餐飲食品中檢測(cè)出金黃色葡萄球菌基因成分。

圖1 餐飲食品中金黃色葡萄球菌的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增圖

（2）金黃色葡萄球菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的靈敏度試驗(yàn)

將純菌培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌液按照煮沸法提取DNA，使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定核酸濃度，梯度倍比稀釋，使用實(shí)時(shí)PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，確定金黃色葡萄球菌的檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，當(dāng)基因組DNA含量為1.0×10-5μg/μL時(shí)，仍可被檢測(cè)出，說(shuō)明實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度極高，且擴(kuò)增曲線與模板DNA含量呈明顯相關(guān)性。

圖2 倍比稀釋的金黃色葡萄球菌菌液DNA的擴(kuò)增曲線曲線從左至右的倍比稀釋濃度依次為：1.0×10-1 μg/μL、1.0×10-2μg/μL、1.0×10-3μg/μL、1.0×10-4μg/μL、1.0×10-5μg/μL、1.0×10-6μg/μL（未檢出）

3 討論

隨著社會(huì)發(fā)展和人民生活方式的改變，餐飲食品以及外賣(mài)食品逐漸成為人民消費(fèi)的主流形式。餐飲食品要經(jīng)過(guò)多道加工程序，如果加工處理以及儲(chǔ)運(yùn)方式不當(dāng)，極易帶入細(xì)菌或?qū)е录?xì)菌的大量繁殖，因此對(duì)餐飲食品的質(zhì)量和快速檢測(cè)提出了更高的要求。餐飲食品及相關(guān)食品中微生物的檢測(cè)一直是食品安全關(guān)注的焦點(diǎn)，其中金黃色葡萄球菌由于可能產(chǎn)生腸毒素對(duì)人體具有較強(qiáng)的危害性，引起人們較多的關(guān)注。文中旨在建立一種能替代常規(guī)微生物培養(yǎng)法檢測(cè)餐飲食品中金黃色葡萄球菌的方法。

為了建立一種快速、靈敏、高效的食品金黃色葡萄球菌的PCR檢測(cè)方法，模板DNA的制備尤為重要。為此，文中對(duì)餐飲食品中金黃色葡萄球菌模板DNA的制備方法進(jìn)行了比較研究。分別采用煮沸法與試劑盒法等2種方法制備金黃色葡萄球菌的DNA模板，2種方法提取的DNA均能擴(kuò)增出金黃色葡萄球菌特異性基因片段，說(shuō)明煮沸法與試劑盒法均適用于餐飲食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)分析。試劑盒法由于使用成本較高，不適合于大量樣品中金黃色葡萄球菌的篩查與檢測(cè)分析。比較而言，煮沸法最為快捷、簡(jiǎn)便易行，節(jié)省試劑消耗，且在試驗(yàn)中可減少菌液和餐飲食品中顆粒物質(zhì)對(duì)PCR的干擾。核酸擴(kuò)增檢測(cè)以及DNA電泳結(jié)果均表明煮沸法提取得到的DNA濃度以及純度能夠滿足PCR檢測(cè)需求。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)比較，文中主要采用煮沸法提取餐飲食品預(yù)增菌液中的DNA。

文中選擇金黃色葡萄球菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操作子基因上的一段特異性序列合成引物，檢測(cè)結(jié)果顯示，引物具有良好的敏感性與特異性。通過(guò)試驗(yàn)不斷篩選和優(yōu)化合適的引物濃度、PCR反應(yīng)體系、退火溫度等條件，建立了穩(wěn)定可靠的金黃色葡萄球菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。文中建立的PCR方法只需經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的增菌即可以用煮沸法提取DNA進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)便快捷，特別適用于大量樣品中金黃色葡萄球菌的快速篩查檢測(cè)。

文中將微生物前增菌技術(shù)與實(shí)時(shí)PCR技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于餐飲食品中金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)中。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌的全過(guò)程在PCR管中得以完成，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的定量和實(shí)時(shí)，省略了常規(guī)PCR的電泳步驟，同時(shí)避免了因電泳帶來(lái)的誤差，且極大降低交叉污染的發(fā)生。該試驗(yàn)中，定量PCR擴(kuò)增曲線對(duì)于不同劑量的DNA模板，在（1.0×10-1～1.0×10-5）μg/μL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，即使樣品中模板DNA濃度低至1.0×10-5μg/μL依然可以被檢出。通過(guò)餐飲食品檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)時(shí)PCR法對(duì)致病菌的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)具有較好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)語(yǔ)

文中將微生物前增菌與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于餐飲食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)中，建立了一整套從樣品采樣、預(yù)增菌、DNA提取到PCR檢測(cè)的方法體系，方法可推廣應(yīng)用于餐飲食品及相關(guān)食品如肉制品等中金黃色葡萄球菌的快速高通量篩查檢測(cè)中，具有較高的應(yīng)用與推廣價(jià)值。