桂枝茯苓方質量控制技術研究進展

路立峰

（山東藥品食品職業學院藥品技術研發中心，山東 威海264210）

桂枝茯苓方由桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、芍藥等5味藥材組成，為治瘀阻胞宮證的經典名方，首載于張仲景《傷寒論·婦人妊娠病脈證并治》篇中，亦為清代黃元御《四圣心源》 收載，名桂枝茯苓湯，其制劑品種現有丸劑（大蜜丸、濃縮丸）、膠囊、片劑、貼劑等，具有活血化瘀、緩消癥塊之功效，臨床上廣泛用于治療女性痛經、子宮肌瘤、慢性盆腔炎、子宮內膜異位癥、卵巢囊腫等，也用于治療男性前列腺增生等疾患。目前，對桂枝茯苓方的研究大多集中在化學成分、藥理作用［1］、藥代動力學、臨床應用［2］方面，但鮮有其質量控制方面的報道。因此，本文就近十年來桂枝茯苓方在提取、純化、鑒別、含有量測定等方面出現的新方法、新技術進行歸納總結，以期為該方質量控制及進一步開發應用提供科學依據。

1 提取

2015年版《中國藥典》 收錄的桂枝茯苓方制劑包括桂枝茯苓丸（大蜜丸）、桂枝茯苓片、桂枝茯苓膠囊［3］，提取技術有水蒸氣蒸餾、醇提取、水煎煮。其中，大蜜丸由桂枝、茯苓、桃仁、赤芍、牡丹皮組成，加全粉和蜂蜜制丸；片劑和膠囊由桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、白芍組成，經水蒸氣蒸餾、醇提、煎煮、細粉混合、制粒壓片或填充膠囊而成。此外，尚有閃式提取、動態循環提取、微波提取、半仿生提取等技術應用于桂枝茯苓方制劑的研究。

1.1 閃式提取 閃式提取具有提取效率高、耗能低、操作簡便等特點，適用于熱敏性成分提取，可有效保留組方中活性成分。王正寬等［4］采用單因素試驗結合Box-Behnken響應面法，以水為提取溶劑，沒食子酸、芍藥苷、苦杏仁苷、苯甲酸、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷含有量為指標，確定了內刃轉速5 600 r／min、液固比10.5 ∶1、提取時間60 s為桂枝茯苓膠囊最優閃式提取工藝，指標成分轉移率高于常規煎煮提取。

1.2 動態循環提取 針對桂枝茯苓膠囊提取工藝周期長、能耗高、雜質多的缺點，王正寬等［5］采用動態循環提取法測定沒食子酸、芍藥苷、苦杏仁苷、苯甲酸、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷在醇提、水提工藝中的傳遞變化，確定最優工藝為4倍量90%乙醇提取130 min 后，藥渣加6倍量水提取150 min，該方法高效快速，綜合提取率高，出膏率低，有助于后續工序優化。

1.3 水蒸氣蒸餾提取 藥典中桂枝茯苓片、膠囊是通過對牡丹皮進行水蒸氣蒸餾獲取丹皮酚，而路麗等［6］用水蒸氣蒸餾法提取桂枝中揮發油，確定8倍量水浸泡4 h 后蒸餾提取5 h 作為最佳提取工藝，并進行β-環糊精包合試驗，優選其工藝為桂枝揮發油與β-環糊精投料比為1 ∶6，70 ℃條件下包合2 h，該方法將桂枝揮發油與β-環糊精包合后制成穩定的固態，可增強桂枝茯苓復方的生物利用度。

1.4 微波提取 微波提取是利用微波照射產生的高頻電波，使植物細胞內部的極性分子形成偶極渦流、離子傳導、高頻摩擦等，瞬時沖破細胞壁，目標組分從細胞內釋放到溶媒中的技術，具有節能高效的優點，但也極易造成熱敏成分的破壞。王正寬等［7］以水為溶劑，沒食子酸、芍藥苷、苯甲酸、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷、苦杏仁苷含有量為指標，在單因素實驗基礎上采用正交設計，確定最優微波提取工藝為料液比1 ∶ 6，微波功率6 kW，提取3次，每次20 min，該方法提取效率高，簡便快捷，穩定可靠，并為中試規模下中藥復方有效成分的提取提供了參考依據。

1.5 半仿生提取 半仿生技術以近似于胃、腸道的酸堿水溶液為溶劑，在模擬胃腸道轉運環境下能反映單體成分與有效成分群組的綜合作用。李芳等［8］用二氧化碳超臨界流體萃取桂枝、牡丹皮、赤芍、桃仁混合揮發油，再對萃取后的藥渣與茯苓混合進行回流提取，通過均勻設計法、標準化處理、加權系數綜合評價，確定桂枝茯苓丸半仿生提取工藝優于水提取。

2 純化工藝

2.1 大孔樹脂純化 大孔吸附樹脂具有吸附量大、易解吸、簡便易行的優點。郭先帥等［9］基于單因素試驗研究苦杏仁苷和芍藥苷的吸附洗脫率，通過考察上樣液質量濃度、徑高比、洗脫劑類型及用量，優選出最佳工藝為樣品溶液質量濃度200 mg／mL，樹脂柱徑高比1 ∶9，樹脂體積與上樣量比0.77 ∶1，加4倍量體積水洗，30%乙醇洗脫，AB-8型大孔吸附樹脂可對桃仁、赤芍提取物有效部位進行分離富集。孫永成等［10］以芍藥苷為指標，考察樹脂型號、洗脫溶媒、樹脂重復使用對其吸附、解吸的影響，確定D101大孔樹脂，30%乙醇洗脫，洗脫率可達90.7%，樹脂可重復使用18次，而且該樹脂對白芍、牡丹皮共有成分芍藥苷具有吸附容量大、解吸效果好的優勢，并為純化該成分的產業化提供實驗依據。

2.2 分子印跡技術 分子印跡技術又稱分子烙印技術，在藥品、食品、環境等領域中的應用越來越廣泛，可獲取特定目標分子及其結構類似物，特異性識別和分離高分子聚合物，該技術通過高親和力聚合物材料與模板分子在空間結構上的高度互補，以及官能團之間的相互作用形成聚合物孔，以實現模板分子的親和力和識別。目前，桂枝茯苓方中選用的分子模板有五沒食子酰葡萄糖（1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰葡萄糖）、去氫土莫酸、芍藥苷，制備方法以溶膠-凝膠法為主，可實現三者分離和純化。

倪付勇等［11］采用去氫土莫酸作為分子模板，采用溶膠-凝膠法制備去氫土莫酸分子印跡聚合物，并以后者作填料對桂枝茯苓膠囊進行洗脫、餾分收集和鑒定，發現該方法可從桂枝茯苓膠囊提取物中靶向分離制備去氫土莫酸，并有利于復方或單味制劑中低含量成分的快速定向分離與純化，為單體化合物的制備提供了新思路。顧睿等［12］以芍藥苷為模板分子，溶膠-凝膠法制備分子印跡聚合物，特異性吸附芍藥苷及芍藥苷結構類似物。從中藥復雜成分體系中實現了芍藥苷快速分離。宋亞玲等［13］通過胺化二氧化硅載體，并選擇五沒食子酰葡萄糖作為模板分子制備了二氧化硅表面分子印跡聚合物，從桂枝茯苓膠囊甲醇提取物中分離制備五沒食子酰葡萄糖，實現了其特異性富集、分離與高效制備。曹澤彧等［14］采用分子印跡技術，梯度敲除桂枝茯苓膠囊中主要成分，制備目標化合物，通過離體子宮收縮、LPS 誘導RAW264.7釋放TNF-α、小鼠脾淋巴細胞增殖、子宮肌瘤細胞增殖模型進行活性篩選，發現芍藥苷、丹皮酚、苦杏仁苷可抑制離體子宮收縮，沒食子酸、桂皮醛、五沒食子酰葡萄糖、茯苓多糖能顯著抑制TNF-α 分泌，沒食子酸、芍藥苷、桂皮醛、槲皮素、茯苓多糖能增強免疫緩解盆腔炎作用，芍藥苷、丹皮酚、五沒食子酰葡萄糖、白芍苷能抑制子宮肌瘤細胞增殖，明確了桂枝茯苓膠囊治療原發性痛經、盆腔炎、子宮肌瘤的活性成分。

3 鑒別

目前，在桂枝茯苓方制劑質量評價中大多采用顯微鑒別技術［3］、薄層鑒別技術［3，15］、HPLC 指紋圖譜技術［3］，但一些新技術也逐漸得到廣泛應用。

3.1 GC-MS 王書云等［16］采用水蒸氣蒸餾法提取桂枝茯苓膠囊中揮發性成分，通過GC-MS 技術鑒定出14種，以benzaldehyde（17.75%）和paenonol（68.25%）為主，但與組方配伍的混合藥材、單味藥材揮發性成分種類及含有量存在較大差異，可能與膠囊制備工藝中選擇性地提取該類成分有關。

3.2 直接實時分析-離子源串聯四級桿-飛行時間質譜（DART-Q-TOF-MS）DART-Q-TOF-MS 是一種新興瞬時離子化技術，利用大氣壓條件下氦氣放電而產生激發態原子快速加熱和電場加速，導致瞬間脫附和離子化，運用重組或串聯質譜檢測待測樣品。張偉等［17］采用DART-Q-TOFMS 法對桂枝茯苓膠囊中苦杏仁苷、丹皮酚、芍藥苷、肉桂酸、沒食子酸、苯甲酸進行快速鑒別，與傳統的TLC、HPLC、MS 等技術比較，可極大縮短樣品凈化時間，提高色譜分離性能，具有省時省力、專屬性強、穩定性好的優點。

3.3 指紋圖譜 指紋圖譜是以中藥材、飲片、中藥制劑為研究對象，經處理后采用一定分析手段，得到能標示其化學特征的色譜圖或光譜圖，包括紫外、紅外、近紅外（NIRS）、TLC、NMR、HPLC、GC-MS、高速逆流色譜（HSCCC）、高效毛細管電泳（HPCE）指紋圖譜等，以HPLC 指紋圖譜應用最廣泛，具有專屬性強、穩定性好、重復性高的優點。

3.3.1 HPLC 《中國藥典》，吳修紅團隊，李家春團隊均選擇芍藥苷作為參照物，采用HPLC 法梯度洗脫，建立桂枝茯苓方（膠囊和丸劑）HPLC 指紋圖譜。其中，吳修紅［18］等指認出丸劑中11個主要色譜共有峰；李家春等［19］用LC-MS 法指認出指紋圖譜中的沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、1，2，3，4，6-β-五沒食子酰葡萄糖、肉桂酸、苯甲酰芍藥苷、桂皮醛等13個共有峰，來自白芍、牡丹皮、桂枝，但由于茯苓中三萜類成分與桃仁中氰苷類成分在紫外區具有較強的末端吸收，導致2種藥材在指紋圖譜中的相關性沒有得到體現。

3.3.2 UPLC 林夏等［20］以茯苓酸為對照物，采用UPLC法對桂枝茯苓膠囊中茯苓有效成分三萜進行指紋圖譜分析，確認出20個共有峰，指認出13個來自茯苓，并通過UPLC／Q-TOF／MS 法鑒定出15種成分，可較好地表征其內在質量。馬瑩等［21］在26個共有峰中指認出18個來自茯苓，建立了桂枝茯苓膠囊三萜酸的UPLC／Q-TOF-MS 指紋圖譜，為其制劑質量標準提升提供了參考。

3.3.3 GC-MS 耿放等［22］以正己烷為溶劑，得到桂枝茯苓丸脂溶性成分，通過GC-MS 法標定來自桂枝、赤芍、牡丹皮、桃仁中9個共有峰作為其特征峰，而且10批樣品指紋圖譜相似度均在0.9以上，為整體定性評價該制劑質量提供了有效可靠的參考。

3.4 UPLC／Q-TOF-MS 尹權微等［23］采用UPLC／Q-TOF-MS法定性分析桂枝茯苓膠囊入血成分，將該信息與空白生物樣品、對照提取離子色譜圖、質譜碎裂信息進行比較，初步鑒定出13種原型成分和1個代謝產物（野櫻苷）共14種入血成分，為其定性鑒別提供了一種快速、簡便、可靠的分析手段，并有助于其藥效物質基礎研究的進一步闡釋。

3.5 NIRS NIRS 技術因其快速、準確、無損、富含豐富化學信息、易于在線檢測的優點，成功地應用于現代藥物分析中。宮凱敏等［24］選擇聲光可調濾光器結合近紅外光譜法，結合主成分分析法和偏最小二乘法，以沒食子酸、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、桂皮醛、丹皮酚為指標，建立桂枝茯苓膠囊快速無損定性定量分析。

4 含有量測定

4.1 電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）有研究顯示，無機元素配伍藥物對某些疾病的治療起協同增效作用，而ICP-MS 適合測定藥物中該類成分，具有操作簡便、分析速度快、靈敏度高的優點。康玉等［25］以濃硝酸為消解劑微波消解12批桂枝茯苓膠囊，Ge、In 為內標，灌木枝葉標準物質為質控標準物質，ICP-MS 法進行測定，發現Ca、Na、Mg、Fe、Mn、Sr 等29種無機元素含有量差別不明顯，Be、As、Cd、Sb、Hg、Tl、Bi 等有害元素含有量低。

4.2 液相色譜

4.2.1 HPLC 2015年版《中國藥典》 針對桂枝茯苓方進行了質量控制，測定桂枝中肉桂酸、牡丹皮中丹皮酚、白芍和牡丹皮中芍藥苷、桃仁中苦杏仁苷含有量。楊鵬飛等［26］以乙腈-0.2%甲酸為流動相梯度洗脫，建立HPLC 法同時測定使藥茯苓中的去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫茯苓酸、去氫茯苓酸含有量，進一步完善了桂枝茯苓方的質量控制方法；眾多學者也采用HPLC 法同時測定丹皮酚、芍藥苷含有量［27］；也有學者采用HPLC 法同時測定苦杏仁苷、芍藥苷［28］，以及丹皮酚、芍藥苷、苦杏仁苷含有量［29］。

閆冉等［30］采用轉槳法，以蒸餾水、鹽酸氯化鈉（pH 1.2）溶液、醋酸鹽緩沖液（pH 4.0）、磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）為溶出介質，HPLC 法測定肉桂酸、芍藥苷、丹皮酚含有量，測定累積溶出率，發現同一廠家丸劑不同成分在同一介質中的溶出基本不同步；不同廠家丸劑在同一介質中體外溶出行為具有一定相似性，但仍存在差異，其中pH 1.2的介質對不同廠家間丸劑質量的“鑒別”更具區分性。

二維液相色譜技術已成為HPLC 法測定復雜樣品的發展方向和趨勢，它是通過不同機理色譜柱串聯，將一維組分選擇性轉至二維色譜柱中分析，實現樣品分離分析技術。張艷海等［31］采用雙梯度高效液相系統（DGLC）在線二維色譜分離技術，將苦杏仁苷切至二維色譜中分離，從而提高分離性能，實現桂枝茯苓膠囊中含有量較低的苦杏仁苷與肉桂酸的分離，同時測定芍藥苷、丹皮酚、苦杏仁苷、肉桂酸含有量，該方法有助于消除基質成分干擾，增加測定結果準確性，提高分析效率，可用于桂枝茯苓膠囊質量分析。

4.2.2 UPLC-MS 桂枝茯苓方成分復雜，具有多種藥理活性，僅靠單一成分不能全面表征全方藥效，由此也促成其含有量檢測手段不斷提高，UPLC 比HPLC 更具選擇性和特異性，分離度更好，專屬性更強，廣泛應用到中藥質量控制中，受到科研工作者的青睞。馬瑩等［32］針對桂枝茯苓方中茯苓三萜酸含有量低、紫外吸收差、靈敏度不高的特點，采用UPLC-MS／MS 法同時測定茯苓酸、去氫茯苓酸、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫齒孔酸、松苓新酸含有量，可為該方質量控制提供快速、準確、適應性強的方法。

4.3 GC 石向群［33］根據桂枝茯苓膠囊中牡丹皮活性成分丹皮酚熔點低、加熱易揮發的特性，采用毛細管GC 法，結合程序升溫、氫火焰離子化檢測、外標法測定其含有量。結果，丹皮酚在20～200 μg／mL 范圍內線性關系良好，平均加樣回收率為108.70%，該方法準確可靠，快速簡便，補充完善了色譜技術在桂枝茯苓方定量測定中的應用。

4.4 過程控制 李家春等［34］對96批桂枝茯苓膠囊應用過程控制技術，比較應用過程控制技術前后的主要質控指標。結果，經過程控制后樣品水分、干燥失重、崩解時限均較過程控制前降低，而且波動范圍更?。粵]食子酸、苦杏仁苷、肉桂酸、茯苓多糖、茯苓酸等11個質控成分含有量波動更小，并趨于一致，表明實施過程控制方法及相應技術可提高桂枝茯苓膠囊質量的穩定性和均一性。

5 討論

以桂枝茯苓方為代表的中藥成方制劑是中醫藥產業現代化的重要組成部分，其質量優劣關乎產業持續發展，關系人們身體健康與生命安全。魏瑞麗等［35］對桂枝茯苓膠囊不良反應發生特征進行分析，發現其藥物警戒信號，建立了風險管理方法。近年來隨著制劑工藝的革新，色譜指紋與顯微、薄層、理化定性鑒別的結合及多成分的定量分析，中藥成方制劑質量控制水平取得了巨大的發展。

在秦泗漣等［36］中藥復方“組分結構理論”質量控制模式基礎上，鑒于中藥成方制劑較傳統中藥飲片成分更復雜、藥效物質更多樣，其質量控制難度也更大，由此建議：（1）應考慮成方制劑制備工藝對藥效物質的影響；（2）在指標成分或化學物質組選擇上要兼顧君臣佐使配伍原則，以全面表達其功效與主治；（3）指標成分或化學物質組應有效、安全。

整體觀念是中醫藥的一大特色，故中藥成方制劑質量控制也應體現整體觀。由此建議，在質量檢驗過程中引入一測多評、多維檢測、中藥質量標志物［37］等現代新技術、新方法，實現指標成分的精準定性分析與定量測定，建立中藥整體質量控制標準的精準評價；在制藥過程中重視生產過程環節，引入“質量源于設計”等先進理念，在藥物設計與研發、工藝建模、工藝放大、過程分析，乃至從種植、加工、制劑到流通建立全過程質量控制及可追溯體系，從而保證藥品質量。