氨基糖苷類抗生素聯(lián)合用藥對MDR-Ab的體外的藥敏研究

汪璟璇，王藝穎，趙行健，高天宇，艾陽，陸思靜

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

鮑曼不動桿菌(acinetobacter baumannii ,Ab)為非發(fā)酵需氧革蘭陰性桿菌，屬于莫拉菌科[1]，為院內(nèi)感染機會致病菌，可引發(fā)菌血癥、肺炎、泌尿系統(tǒng)感染、腦膜炎等[2]。隨著抗菌藥物的使用，誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性增強，近年來多重耐藥鮑曼不動桿菌(multi-drug resistance Ab，MDR-AB)在臨床分離菌中檢出率維持在高水平，甚至泛耐藥鮑曼不動桿菌(X-drug resistant XDR-AB)及全耐藥菌株(Pan-drug resistant PDR-AB)均被檢出，可見當(dāng)前耐藥形勢極為嚴(yán)峻。氨基糖苷類因其不良反應(yīng)，臨床較少應(yīng)用于老年及兒童這一群體，但隨著硫酸依替米星等新一代藥物問世，氨基糖苷類的應(yīng)用機率增加。已知目前氨基糖苷類為主與其他抗菌藥物聯(lián)較合方面的研究較少，本實驗選用氨基糖苷類中的三種抗菌藥物——硫酸依替米星、阿米卡星和慶大霉素分別與頭孢哌酮/舒巴坦、多黏菌素B、替加環(huán)素、美羅培南和哌拉西林/舒巴坦聯(lián)合，以探究體外聯(lián)合的最佳方案。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株來源

實驗菌株為2016年11月至2017年9月錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸二病區(qū)臨床送檢標(biāo)本中分離的不重復(fù)的MDR-AB 35株。

1.1.2 抗菌藥物

頭孢哌酮/舒巴坦1.5 g(1∶1) (大連輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20020597)、美羅培南(住友制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20140169)、慶大霉素(國藥集團(tuán)容生制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H41020609)、阿米卡星(齊魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H37020562)、依替米星(常州方圓制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20020129)、多黏菌素B(SIGMA公司，批號1222536)、替加環(huán)素(海正藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字H20123339)、哌拉西林/舒巴坦2.5 g(4∶1) (哈藥集團(tuán)制藥總廠，國藥準(zhǔn)字H20051178)。

1.1.3 培養(yǎng)基

Muller-Hinton(MH)肉湯(上海萬疆生物技術(shù)有限公司)、瓊脂粉(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)有限公司)

1.1.4 實驗設(shè)備

MDF-192(N)-80 ℃超低溫冰箱(Sanyo公司)、MBR-506D(H)4 ℃冰箱(Sanyo公司)、DHP060 恒溫培養(yǎng)箱 (上海實驗儀器廠)、360ES-A電子天平[普利賽斯國際貿(mào)易(上海)有限公司]、SW-CJ超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、WGZ-XT比濁儀(杭州大吉光電儀器有限公司)。

表1 抗菌素名稱及起始濃度

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株鑒定和藥敏實驗

用美國Microscan Walk Away 40 全自動微生物鑒定系統(tǒng)對菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.2 微量肉湯稀釋法

采用96-孔板微量肉湯稀釋法測定選用的8種抗生素單藥MIC值。配好抗生素母液，設(shè)定起始藥物濃度，倍比稀釋到最低共11個濃度梯度(1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512以及1∶1 024)。采用棋盤法進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗，將藥物兩兩組合加入96孔平板中。記錄兩藥聯(lián)合應(yīng)用時各自的MIC甲藥聯(lián)用和MIC乙藥聯(lián)用，以計算FIC指數(shù)，即部分抑菌濃度指數(shù)，F(xiàn)IC指數(shù)=MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用。

1.2.3 聯(lián)合效應(yīng)判讀標(biāo)準(zhǔn)[16]

FICI≤0.5，協(xié)同作用；0.52.0拮抗作用。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

35株MDR-AB均對頭孢哌酮/舒巴坦、美羅培南、哌拉西林/舒巴坦、硫酸依替米星全耐藥，阿米卡星耐藥率97.1%，慶大霉素耐藥率68.6%，替加環(huán)素耐藥率為22.9%，多黏菌素B耐藥率14.3%。其中多黏菌素B敏感率最高，替加環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星次之，見表2。

硫酸依替米星單藥及聯(lián)合后的MIC范圍、MIC90見表3所示，可知硫酸依替米星與哌拉西林/舒巴坦聯(lián)合后，MIC90降為單藥時的1/16；與多黏菌素B、替加環(huán)素聯(lián)合后，MIC90降為單藥的1/2。與頭孢哌酮/舒巴坦、美羅培南聯(lián)合后，MIC90升為原來2倍。

表2 35株MDR-AB藥敏結(jié)果

注：CPS為頭孢哌酮/舒巴坦；MEM為美羅培南，PIS哌拉西林/舒巴坦，ETM為硫酸依替米星，AMK為阿米卡星，GM為慶大霉素，TGC為替加環(huán)素，PLB為多黏菌素B

表3 硫酸依替米星及聯(lián)合5種抗生素的單藥及聯(lián)合用藥對35株MDR-AB 的MIC范圍、MIC90的比較

注：MIC范圍:抑制細(xì)菌生長所需藥物的最低濃度范圍；MIC90:抑制90%細(xì)菌生長MIC值

如圖1所示，硫酸依替米星與哌拉西林/舒巴坦聯(lián)合后，濃度-累計抑菌百分率曲線左移最為顯著，替加環(huán)素、多黏菌素B次之。

阿米卡星單藥及聯(lián)合后的MIC范圍、MIC90見表4所示，可知阿米卡星與多黏菌素B、替加環(huán)素聯(lián)合后，MIC90降為單藥的1/4。與頭孢哌酮/舒巴坦、美羅培南聯(lián)合后，MIC90升為原來2倍。

如圖2所示，阿米卡星與替加環(huán)素、多黏菌素B聯(lián)合后，濃度-累計抑菌百分率曲線左移。

慶大霉素單藥及聯(lián)合后的MIC范圍、MIC90見表5所示，可知慶大霉素與多黏菌素B聯(lián)合后，MIC90降為單藥的1/8；與替加環(huán)素聯(lián)合后，MIC90降為單藥的1/4；與頭孢哌酮/舒巴坦、美羅培南聯(lián)合后，MIC90升為原來2倍。

如圖3所示，慶大霉素與替加環(huán)素、多黏菌素B聯(lián)合后，濃度-累計抑菌百分率曲線左移。

硫酸依替米星與哌拉西林/舒巴坦、替加環(huán)素、多黏菌素B聯(lián)合，F(xiàn)IC指數(shù)大多分布在小于等于1的范圍內(nèi)，主要呈協(xié)同和相加作用；與頭孢哌酮舒巴坦、美羅培南聯(lián)合，F(xiàn)IC指數(shù)大多分布在1至2范圍內(nèi)，主要呈無相關(guān)和拮抗作用，見表6。

表4 阿米卡星及聯(lián)合4種抗生素的單藥及聯(lián)合用藥對35株MDR-AB的MIC范圍、MIC90的比較

表5 慶大霉素及聯(lián)合4種抗菌素的單藥及聯(lián)合用藥對35株MDR-AB 的MIC范圍、MIC90的比較

表6 硫酸依替米星與5種藥物組合FIC指數(shù)構(gòu)成比(%)

注：X2=110.758，P=0.000

FIC≤0.5，協(xié)同作用；0.52.0拮抗作用；P<0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義。

阿米卡星與多黏菌素B、替加環(huán)素聯(lián)合，F(xiàn)IC指數(shù)大多分布在小于等于1的范圍內(nèi)，主要呈協(xié)同和相加作用；與頭孢哌酮舒巴坦、美羅培南聯(lián)合，F(xiàn)IC指數(shù)大多分布在1至2范圍內(nèi)，主要呈無相關(guān)和拮抗作用，見表7。

慶大霉素與多黏菌素B、替加環(huán)素聯(lián)合，F(xiàn)IC指數(shù)大多分布在小于等于1的范圍內(nèi)，主要呈協(xié)同和相加作用；與頭孢哌酮舒巴坦、美羅培南聯(lián)合，F(xiàn)IC指數(shù)大多分布在1至2范圍內(nèi)，主要呈無相關(guān)和拮抗作用，見表8。

表7 阿米卡星與4種藥物組合FIC指數(shù)構(gòu)成比(%)

注：χ2=101.881，P=0.000

表8 慶大霉素與4種藥物組合FIC指數(shù)構(gòu)成比(%)

注：χ2=60.632，P=0.000

3 討 論

鮑曼不動桿菌為21世紀(jì)重要的臨床致病茵，可引發(fā)菌血癥、肺炎、泌尿系統(tǒng)感染、腦膜炎等，其中主要為呼吸道感染，并可從痰液、全血、創(chuàng)口分泌物、尿液、膿液或胸水、腹水中檢出，本實驗標(biāo)本均來源于呼吸內(nèi)科，與文獻(xiàn)報道相符[17]。根據(jù)最新CHINET[3]顯示，該菌在臨床分離株中檢出率為10.77%，與2015年[4]基本持平。在最新CHINET[3]481-491中，阿米卡星、慶大霉素、美羅培南、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率分別為50.5%、63.3%、43%、71.4%，本實驗中上述藥物耐藥率高達(dá)68%以上，與最新監(jiān)測結(jié)果相符。

氨基糖苷類抗生素主要通過與核糖體30s亞基16srRNA結(jié)合抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)生成達(dá)到抑菌目的[5]。由于其耳毒性、腎毒性，氨基糖苷類藥物在臨床應(yīng)用中受到限制[6]，其中硫酸依替米星屬于半合成水溶性氨基糖苷類抗生素，與前代氨基糖苷抗生素相比耳毒性、腎毒性、神經(jīng)肌肉麻痹、變態(tài)反應(yīng)等不良反應(yīng)的發(fā)生率均已顯著降低[7]，硫酸依替米星已在臨床老年人抗感染治療中應(yīng)用，并獲得較良好的療效[8]。本實驗中硫酸依替米星與哌拉西林/舒巴坦聯(lián)合效果較佳，考慮可能原因為哌拉西林為青霉素類抗生素，主要作用于細(xì)菌菌體內(nèi)的青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成，并借助細(xì)菌自溶酶使其溶解產(chǎn)生抗菌作用；依替米星抑菌機制為作用于核糖體影響蛋白生成，兩者結(jié)合可能是哌拉西林/舒巴坦通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成使其失去滲透屏障，使硫酸依替米星易于與核糖體30SrRNA結(jié)合達(dá)到抗菌目的，同時哌拉西林/舒巴坦是復(fù)合制劑，舒巴坦可保護(hù)β-內(nèi)酰胺酶不被水解[9]。

3種氨基糖苷類抗生素與多黏菌素B聯(lián)合均呈現(xiàn)較好效果。多黏菌素B作為專家共識[10]提出的治療MDR-AB感染的重要藥物，其主要作用機制為破壞細(xì)菌的胞質(zhì)膜，使胞質(zhì)外漏，影響核糖體與細(xì)胞核功能[11],這一特點促使細(xì)菌不易對其耐藥。氨基糖苷類抗生素與其聯(lián)合后，多黏菌素B可能使細(xì)胞膜遭到破壞，利于氨基糖苷類抗生素進(jìn)入并與核糖體蛋白結(jié)合，產(chǎn)生抗菌效果。

替加環(huán)素作為另一種治療MDR-AB感染的藥物，這3種氨基糖苷類抗生素與之聯(lián)合也呈現(xiàn)較高協(xié)同率。替加環(huán)素可通過與核糖體30S亞基結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)運核糖核酸進(jìn)入核糖體A位點，進(jìn)而抑制氨基酸殘基肽鏈形成，阻斷蛋白翻譯，而抑制細(xì)菌蛋白形成[12]。而氨基糖苷類耐藥機制中有產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶[13]，通過與替加環(huán)素聯(lián)合，可能為替加環(huán)素阻斷蛋白翻譯過程，干擾了細(xì)菌產(chǎn)生修飾酶，從而解除了氨基糖苷類的耐藥性，使得這3種氨基糖苷類藥物與替加環(huán)素聯(lián)合效果較好。

本實驗中這3種氨基糖苷類藥物與美羅培南聯(lián)合呈拮抗作用，考慮可能與AB對這兩類藥物的耐藥機制中外排泵有關(guān)。AdeABC為鮑曼不動桿菌所特有的外排系統(tǒng)，該系統(tǒng)中存在一個由 AdeA、AdeB 和 AdeC 組成的三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。所有鮑曼不動桿菌均可擴增出藥物外排泵基因adeB,其中AdeA、AdeC 共同形成的三聚體外排結(jié)構(gòu)，參與對氨基糖苷類與碳青霉烯類等多種藥物的外排[14]。細(xì)菌通過外排系統(tǒng)可能將美羅培南及這3種氨基糖苷類藥物排出菌體外，從而使得美羅培南與這3種藥物聯(lián)合效果不佳。

此外實驗中的3種氨基糖苷類抗生素與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合拮抗率較高，推測可能與AB的耐藥機制中的超廣譜-內(nèi)酰胺酶有關(guān)。其中PER-1型β-內(nèi)酰胺酶除可水解頭孢哌酮舒巴坦外，還可水解阿米卡星、慶大霉素等氨基糖苷類藥物[15-17]。

在本研究中，硫酸依替米星與哌拉西林/舒巴坦、多黏菌素B或替加環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用取得較好效果，其協(xié)同率分別為48.5%、42.9%和37.1%。其次為阿米卡星與多黏菌素B、慶大霉素與多黏菌素B聯(lián)合應(yīng)用，其協(xié)同率均為34.3%，以上結(jié)果均可為臨床聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物治療多重耐藥鮑曼不動桿菌提供新的方案。

本實驗著重于探究氨基糖苷類抗生素與其他抗菌藥物的體外聯(lián)合用藥效果，體內(nèi)效果待完善后續(xù)研究加以補充。

(此文圖1-3見附頁5)