載壬苯醇醚聚L-乳酸電紡纖維的表征

黃佳娜，劉陽，羅徐，王浩，程博聞

(1.錦州醫科大學藥學院，遼寧 錦州 121001；2.山東省醫用高分子材料重點實驗室山東省藥學科學院，山東 濟南 250100；3.天津工業大學紡織學院，天津 300387)

5000多年前，古埃及婦女將金合歡穗纖維精磨后混以動植物避孕成分置入陰道用來避孕，這是第一種載活性成分的纖維形態的藥劑。受其啟發，擬采用靜電紡絲技術制備一種載避孕成分壬苯醇醚(nonoxinol，NNX，結構式見圖1A)的纖維。近十多年來， 人們采用靜電紡絲技術制備載藥的微、納米級的纖維來對藥物進行控制釋放，其外觀為無紡薄氈，十分適合體內植入、體表皮膚粘膜貼敷及腔道充塞給藥[1-3]。制備該類載藥纖維一般選擇人體相容性好的、無毒的聚氧乙烯、聚乙烯醇、脂肪族聚酯等，這其中采用脂肪族聚酯等疏水的高分子制成的電紡纖維對包裹的藥物會有緩釋作用，可以達到特殊的藥劑學目的[4-6]。

NNX為一種外用的非離子型表面活性劑殺精子劑，其與水可以以任意比例混溶，已經上市的制劑一般為由親水的線形高分子材料如聚乙烯醇等為基材形成的膜劑，或者以水性基質載藥系統如水凝膠[7-9]。NNX發揮作用的機理為與精子細胞膜作用是使得膜的通透性增加，內容物漏出導致精子死亡。同樣的，其亦可對其他種類的細胞膜起作用，比如導致婦女陰道上皮細胞損傷而引起刺激。其現有劑型也會有使用不便、儲存穩定性差、藥效時間短等問題的出現，故可以考慮進一步開發其他劑型。

以最常使用的聚L-乳酸(poly L-lactic acid，PLLA，結構式見圖1B)包裹 NNX，期望得到一種能在一定程度上緩釋NNX的纖維，規避該化合物和其現有制劑的缺點。

1 儀器與材料

靜電發生器(杭州旭強涂裝儀器廠)，廣角X-射線衍射儀(日本Rigaku，Ultima IV)，差示熱分析儀(德國Netzsch，DSC200F3)，紅外光譜(日本Shimadzu，IRAffinity-1)，紫外-可見分光光度計(日本Shimadzu，UV-VIS2550)，恒溫空氣浴搖床(THZ-82A型，浙江金壇天竟實驗儀器廠)。

壬苯醇醚(分析純，大連美侖生物科技)，月桂醇-聚L-乳酸(相對分子量為20萬，山東藥學科學院)，二氯甲烷(分析純，天津大茂化學試劑廠)，去離子水(杭州娃哈哈集團)。

2 方 法

2.1 靜電紡絲及形態觀察

將NNX和PLLA溶解在二氯甲烷中，磁力攪拌 5 h 得無色、透明、均一的紡絲溶液，用二氯甲烷定容至 10 mL 得到3份待紡絲溶液。其中PLLA的用量均為0.6 g，NNX的用量分別為0.12、0.24、0.48 g，即NNX占PLLA的質量比分別為20%、40%、80%，由此3個處方得到的產品分別命名為F20、F40、F80。借此考察不同載量的NNX對電紡纖維形態及其本身的釋放行為的影響。由于NNX為一種表面活性劑，有助于降低PLLA二氯甲烷溶液的表面張力，故Taylor錐的形成和在電場下的進一步紡絲都十分順利，體系中沒有也無需再添加其他導電物質輔助電紡纖維的形成，即體系中只含有活性藥物NNX和基質材料PLLA[10]。

紡絲條件如下：紡絲電壓為15 000 V，供液速度為(2.5±0.5)mL/h，針尖與錫箔平面之間的距離即紡絲距離為15 cm，空氣溫度為(25±2)℃，空氣相對濕度為60%。發現從噴絲口流出的紡絲液在電場力的作用下以高速不規則的螺旋軌跡運行，在接收板上織構成無紡纖維薄氈，紡絲完畢后約0.2 mm厚的氈膜。揭下纖維膜后，(35±5) ℃下真空抽干48 h，按照一定規格剪刀切成小片后進行表征，藥物釋放等研究[11-13]。

2.2 物理表征

2.2.1 X-射線衍射

剪下5 cm×5 cm纖維膜固定在鏤空的金屬片上并置于廣角X-射線衍射儀，室溫下測試，掃描范圍：5°～60°，掃描速率：2°/min。

2.2.2 差示熱分析

稱量10 mg纖維氈膜，置于差示熱分析儀氮氣流保護下溫度量程從25～400 ℃，升溫速率：5 ℃/min。

2.2.3 傅里葉變換紅外光譜

取溴化鉀粉末200 mg，加入待測樣品1 mg中，置丙酮清洗并用紅外燈烘干的瑪瑙研缽中，研細后置入組裝的壓片裝置中，以80 MPa的壓力在壓片機下壓片5 min，得到溴化鉀片，放入樣品槽，在測定選項下點擊樣品測試按鈕進行掃描。

2.3 藥物釋放

2.3.1 含量分析方法

采用紫外分光光度法測定釋放介質種NNX的含量。分別配制16、32、100、160、225、250、350、400 μg/mL系列濃度NNX的純水溶液，采用紫外-可見分光光度計在200～600 nm范圍內掃描，通過檢測最大吸收波長處不同濃度的NNX水溶液的吸光度，建立回歸系數高的工作曲線，用于定量測定釋放介質中NNX的含量[14]。

分別配制400、350、250、225、160、100、32、16 μg/mL系列濃度NNX的純水溶液，采用紫外-可見分光光度計在200～600 nm范圍內掃描，通過檢測最大吸收波長處不同濃度的NNX水溶液的吸光度，建立回歸系數高的工作曲線，用于定量測定釋放介質中NNX的含量。

2.3.2 釋放曲線繪制及擬合

將樣品剪切成約5 cm×5 cm正方形條，使得每片的質量約為(200±5) mg，浸入10 mL純水釋放介質中。置于恒溫空氣浴搖床中在37 ℃，100 r/min條件下振搖釋放。在設定的時間點0.25、0.5、1、2、4和8 h取出全部釋放介質，同時補充同溫等量介質。并按照2.3.1的方法測定NNX的含量。計算每個時間點的NNX釋放量，繪制出相對釋放百分率對時間t的曲線，并采用Freundlich和Peppas方程式對所得曲線進行擬合[11-13]249-255,82-88,155-162。

3 結果與討論

3.1 纖維形態

所制得的纖維膜在外觀上均為純白色，將其剪切成1 mm×3 mm小片后用導電膠固定在載玻片上并用金真空蒸鍍后電鏡觀察。圖2為不同載藥量纖維氈在不同放大倍率下的微觀形態，發現得到了直徑均一無珠子結構的纖維，由于NNX是一種較好的表面活性劑，故在PLLA的二氯甲烷單溶劑中其亦能夠順利形成纖維，這在已有文獻中亦能夠發現[10-12] 227-231,249-255,82-88。并且，纖維表面光滑，無結晶狀或塊狀結構出現。同時發現在纖維交叉的部分有相互融合的現象，這可能是由于紡絲用的二氯甲烷在短時間內沒有完全揮發使得在纖維交叉處黏連導致的，這使得纖維在二維平面上無規則織構，并層層累積形成三維薄片狀無紡膜，這有利于增強纖維的機械強度，使其有利于作為一種外用貼敷制劑進行使用。

3.2 壬苯醇醚的包裹

聚L-乳酸的X-射線衍射圖譜有兩個非常明顯的特征峰，在載NNX的PLLA電紡纖維中并沒有出現，但是載NNX40%和80%的PLLA纖維在16.8°處衍射強度增強。說明NNX復合量的增高提高了PLLA的結晶性，這可能會導致包裹在其中的NNX出現百分釋放率降低的結果。差示熱分析圖譜上的特征峰全部為PLLA的峰，包括150～200 ℃的熔化峰和250～380 ℃的分解峰。其受到復合入纖維的NNX的影響，表現在熔化峰和分解峰的極大值均向低溫移動，尤其是分解峰極值的移動大于20 ℃。這說明NNX的存在降低了PLLA的結晶性，這提示兩者之間有著較好的復合乃至較強的結合。傅里葉變換紅外光譜的結果顯示當NNX復合量為20%時，PLLA的特征峰均幾乎消失，當NNX復合量為40%和80%時，呈現出強度不大的PLLA特征峰，特征峰的幾乎消失說明NNX與PLLA復合良好[10-12]227-231,249-255,82-88，而微弱呈現說明NNX與PLLA發生了一定的離析。

綜合以上兩個表征的結果不難發現，當NNX復合量增高后，纖維表面結晶性由弱變強，內部的結晶性由強變弱，而NNX是無結晶性的分子，提示NNX的復合量在增高后其可能更多的分布于纖維的內部，并且相當一部分的NNX與PLLA發生了一定程度的離析。

3.3 壬苯醇醚含量測定和釋放曲線

系列濃度的NNX水溶液在200～600 nm內掃描后，得系列掃描曲線如圖6A，發現在276 nm處NNX的濃度與吸光度有著較好的線性關系，以NNX的濃度為橫坐標，選擇與之相對應的276 nm處的吸光度值為縱坐標得系列坐標點，得到工作曲線如圖6B，擬以此作為釋放介質中NNX的定量依據。

3種不同的纖維膜中NNX的絕對釋放量如圖5A。可以發現，各種纖維均在15 min后有一定的釋放量，在4 h內呈現明顯的緩釋相，在4～8 h幾乎進入平臺期，隨著壬苯醇醚載量的增高，其絕度釋放量也逐漸有所增高。但是，將絕對釋放量換算成百分釋放量可以發現，隨著載量的升高，其百分釋放量和相同時間點的百分釋放率并不隨之增高，而是隨之降低，即載量越高，不能釋放的壬苯醇醚比例就越多。引起此種現象的原因可能是紡絲液內部的NNX發生了自組裝。由于紡絲液為PLLA的二氯甲烷溶液呈現疏水性，故較高載量時，相當部分的NNX可能在紡絲液內部形成反膠束，即NNX的聚乙二醇親水部分聚集在膠束內部并有可能與聚酯的酯鍵部分或二氯甲烷中的微量水分子通過氫鍵等作用力較強的鍵相互作用，疏水的壬苯基則在膠束的外部，阻止水分子對其滲透和溶解。可以發現，3.2中物理表征的結果對上述結果和推測有所佐證。

從有較大的突釋、突釋過后具有明顯的緩釋期、百分釋放量隨著其本身載量的增高而降低等若干事實可以初步推斷NNX在纖維中以三種基本情況存在：一部分NNX在纖維外周存在并且與PLLA的作用并不強，當纖維浸入到水中后，這些NNX分子會首先在較短的時間內釋放出去導致突釋。第二種是在纖維較內部處存在，并且與PLLA的作用亦不強，在浸入到水中后，其從纖維內部通過擴散機制緩慢釋放形成釋放曲線的緩釋相。第三種是形成了穩定的結構，在本論文設定的時間段內并不隨著實驗的進行而溶解釋放，在釋放曲線上形成了平臺期。并且有相當部分仍滯留在纖維中，尤其是這種現象隨著其載量的增高而越發明顯，形成了載量越高而釋放百分率越低的現象[15]。

為了研究多西紫杉醇的釋放機理，采用Freundlich方程式和Peppas方程式對釋放曲線進行了擬合，結果見表1。可以發現，對兩種方程式擬合后的回歸系數均較高。

表1 壬苯醇醚釋放曲線的擬合方程式

Freundlich方程式主要描述材料表面小分子的吸附和逆吸附過程，有研究發現，在水溶性表面活性劑復合的脂肪族聚酯電紡纖維中，前者從后者中的釋放符合逆吸附方式，提示有相當多的表面活性劑在纖維表面以及靠近纖維表面的部位存在。從表1的結果看，本文中的NNX復合PLLA電紡纖維中前者的釋放即遵循該機理。在局部給藥時，一般需要較大的突釋量，以使得病灶組織種藥物達到一個較高濃度，為后續藥物的逐漸釋放并且在局部組織保持足量的藥物濃度提供了基礎。但是，亦有相當量的NNX在相當長的時間后沒有釋放出來，提示該部分的NNX存在于纖維斷面深部，甚至較靠近圓心的部位，并且與PLLA復合緊密。所以難以被溶出纖維。

Peppas方程式主要描述在水不溶性高分子基質中水溶性藥物的釋放行為。從表1的結果看，其擬合系數亦較高。但發現指數n均小于0.5，相比于常見的數值小很多。本文首次采用Peppas方程式對從電紡纖維中表面活性劑的釋放曲線進行擬合，指數n的具體意義和對進行設計的指導還有待進一步的研究。該結果提示了當NNX復合量較多時，其進一步地深入到PLLA內部，繼表面和近表面部位NNX的釋放后，較內部的NNX通過擴散機理從纖維橫截面的較深部位緩慢擴散移動至邊緣并釋放形成緩釋相，故能夠用Peppas方程式擬合。

綜上不難發現，從NNX的釋放曲線佐證了物理表征的結果，并可以依此推測NNX在電紡纖維橫斷面中的存在位置和復合情況。

4 結 論

本研究通過NNX與聚L-乳酸共同溶解形成均相溶液后紡絲的方法將前者包裹在后者中，并通過后者的疏水性所引起的阻止擴散機理對前者進行緩釋，得到了能夠緩釋NNX的無紡纖維氈。根據NNX釋放的結果可以得到以下三點結論：(1)NNX的釋放不但符合Pappas擴散方程式，還符合Freundlich方程式，據此分析被載的NNX有相當一部分存在與纖維表面及靠近纖維表面的部分；(2)隨著NNX載量的升高，其并沒有向纖維表面或靠近纖維表面的部位分布，而是繼續分布于纖維內部，所以經過換算后其釋放的NNX與包裹的NNX，即百分釋放量不升反降；(3)被載的NNX有相當一部分與聚L-乳酸結合牢固，不能在設定的釋放時間內釋放，是其不能釋放完全的原因。

通過靜電紡絲的方法將表面活性劑包裹在脂肪族聚酯中的研究方興未艾，本文中NNX復合的PLLA電紡纖維優點有二：(1)由于被擔載的物質本身即能夠降低液滴表面張力，故該種體系中不需再添加額外的表面活性劑來保持Taylor錐的順利形成和纖維直徑的均勻性；(2)相比于Poloxamer188復合的PLLA電紡纖維，其緩釋相較為明顯，且突釋較小。可以作為一種陰道用避孕藥劑進行進一步研究開發。

(此文圖1-7見附頁2-4)