5-氮-2-脫氧胞苷對人膀胱癌細胞株5637細胞生長及RUNX3基因甲基化的影響

王 磊

（江西衛生職業學院，江西南昌，330052）

RUNX3(human runt—related transcription factor 3)基因是近來研究較多的一個腫瘤抑制基因，該基因是位于染色體lp36，全長67kb，內有啟動子p1、p2兩個、外顯子6個和開放閱讀框1290bp[1]。在這2個啟動子中富含有GC，特別是在p2啟動子中GC的含量為64%，容易出現甲基化改變[2]。對于基因的甲基化和去甲基化現象，這是細胞生長和分化的重要程序，可是在腫瘤的發生發展中則會發生紊亂。研究中，通過在使用不同濃度的去甲基化藥物5-Aza-CdR對膀胱癌5637細胞株處理后，檢測RUNX3基因的甲基化情況、表達變化、對細胞增殖及凋亡的影響，進而可能為膀胱癌的早期診斷與檢測、治療以及預后提供依據，尋找新的治療靶點。

1、實驗材料

膀胱癌細胞株5627細胞。

2、實驗方法

2.1 細胞培養、分組 將處于對數生長期的5637細胞株接種到細胞培養板，分為 A、B、C、D4個組別。

2.2 加入不同濃度5－Aza－CdR培養 4組分別加入未加藥的細胞株作為對照組(A組)、加入低濃度（1umol/l）(B組)、中濃度（16umol/l）(C 組)、高濃度（64umol/l）(D 組)的 5－Aza－CdR，繼續培養，收集上述幾組實驗組細胞待測。

2.3 流式細胞儀 檢測各個組別的細胞凋亡情況。

2.4 甲基化特異性PCR(MSP)方法 檢測給藥前后RUNX3基因甲基化的差異。

2.5 RT－PCR法 檢測用藥前后RUNX3基因mRNA表達的變化。

2.6 Western blot檢測 用藥前后RUNX3蛋白表達水平的差異。

3、統計學處理

采用SPSS19.0統計學軟件對所有數據進行分析處理，PCR數據和流式細胞數據均采用Welch檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

4、實驗結果

4.1 不同濃度5-Aza-CdR對膀胱癌5637細胞增殖的影響 與對照組相比較，膀胱癌5637細胞用5-Aza-CdR處理后，細胞的增殖受到抑制，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同濃度的5-Aza-CdR作用下，細胞增殖抑制程度有差異性，有統計學意義（P＜0.05）。結果表明，隨著5-Aza-CdR濃度的不斷增加，膀胱癌5637細胞的抑制率明顯增大。

4.2 不同濃度5-Aza-CdR對膀胱癌細胞株5637細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測，5637細胞在5-Aza-CdR作用后，實驗組與對照組存在差異，差異有統計學意義（P＜0.05），不同濃度的實驗組，組間有差異，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果顯示，5-Aza-CdR作用后，細胞凋亡率增加。隨著濃度的不斷增加，細胞凋亡率也在增加，成劑量依賴性關系。

4.3 5-Aza-CdR對膀胱癌5637細胞RUNX3基因甲基化的影響 甲基化特異性PCR（MSP）法用于檢測膀胱癌5637細胞RUNX3甲基化，從實驗結果可以看出實驗組（5-Aza-CdR濃度為16umol/l）和對照組(未添加5-Aza-CdR)RUNX3甲基化不同。處理前，甲基化引物擴增條帶呈陽性，非甲基化引物擴增條帶呈陰性。用5-Aza-CdR處理后，膀胱癌5637細胞的甲基化引物擴增條帶表現為陰性，而非甲基化引物擴增條帶表現為陽性。

結果表明，膀胱癌537細胞中RUNX3基因存在甲基化，藥物5-Aza-CdR可逆轉RUNX3甲基化狀態，使其成為非甲基化狀態。

4.4 不同濃度5-Aza-CdR處理后對膀胱癌5637細胞RUNX3 mRNA的表達影響 RT-PCR檢測在不同濃度5-Aza-CdR處理后，5637細胞RUNX3mRNA的表達情況。結果可以看出，5-Aza-CdR處理后RUNX3mRNA的表達增加，差異具有統計學意義（P＜0.05），各組之間隨著 5-Aza-CdR濃度不斷增加，RUNX3mRNA的表達也不斷增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結果顯示，膀胱癌5627細胞經過5-Aza-CdR處理后，隨著濃度的增加RUNX3 mRNA的表達也不斷增加。

4.5 不同濃度5-Aza-CdR處理后對膀胱癌5637細胞RUNX3蛋白表達的影響 實驗結果顯示，與對照組相比，5-Aza-CdR處理膀胱癌5637細胞后，RUNX3蛋白的表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05），不同濃度5-Aza-CdR之間，RUNX3蛋白的表達有差異，有統計學意義（P＜0.05）。隨著濃度的不斷增加，RUNX3蛋白的表達也在增多。

5 討論

隨著我們對腫瘤的深入研究，顯示腫瘤的發生可能與癌基因的激活和抑癌基因的失活等存在聯系，因此，尋找與腫癌相關的抑癌基因對了解腫瘤的發病、監測、預后判斷以及開展基因治療有十分重要的意義。

膀胱癌是目前我國最為常見的泌尿系統腫瘤。膀胱癌的診斷主要是依賴膀胱鏡檢查以及病理活檢，但對于膀胱癌早期的監測較差。因此，努力找到一種能夠早期對膀胱癌作出診斷且敏感性和特異性均比較高的腫瘤標志物，找到可行性的治療方式，這將為膀胱癌的診斷、生物治療及預后提供很大的幫助。

5.1 RUNX3基因的甲基化與腫瘤 RUNX3基因甲基化的出現主要是在p2的CpG島，基因出現甲基化后，將導致基因的表達受到抑制，而RUNX3表達受到抑制，將會影響細胞的凋亡，促進腫瘤的發展。

在之期的研究中，40例膀胱癌和10例正常膀胱黏膜組織中，RUNX3基因在膀胱組織的陽性表達率（40%，16/40）明顯低于其在正常膀胱組織中的陽性表達率（90%，9/10）（P ＜0.05）；RUNX3基因在膀胱癌組織中的陽性表達與患者年齡、性別因素無關（P＞0.05），與膀胱癌組織的病理分級和臨床分期有關（P＜0.05）；在本次實驗中，通過MSP法檢測膀胱癌5637細胞發現RUNX3基因存在甲基化。這也進一步證實了RUNX3基因的甲基化造成了抑癌基因RUNX3的失活。

5.2 5-Aza-CdR的作用 5-Aza-CdR作為甲基化抑制劑，可使甲基化狀態的基因重新激活表達，促進癌細胞凋亡及抑制癌細胞增殖，從而發揮抗癌作用。劉正人等[3]探討5-Aza-CdR對膽管癌細胞TFK-1侵襲力的影響及其機制，發現5-Aza-CdR對膽管癌細胞侵襲力有顯著性抑制。本次實驗中，在經過5-Aza-CdR處理后，膀胱癌5637細胞的增殖率下降，細胞凋亡率升高，并且隨著5-Aza-CdR濃度的不斷增加，細胞凋亡增加。這和其他人研究結果相同，說明5-Aza-CdR可以作為膀胱癌治療的一個考慮方向。

5.3 5-Aza-CdR與RUNX3的去甲基化 基因的甲基化屬于表觀遺傳學修飾，是一種可逆的過程，通過甲基化抑制劑可以誘導抑癌基因的重新表達，從而達到治療腫瘤的目的。[4]

之前，唐莉菲等[5]對40例宮頸癌患者進行了研究，觀察到RUNX3啟動子異常甲基化與宮頸癌的發生發展有關，有望在宮頸癌的早期檢測中成為生物學標志之一。本次實驗發現，在膀胱癌5637細胞中，經過不同濃度5-Aza-CdR處理后，隨著濃度的增加，RUNX3mRNA表達隨之增加，RUNX3蛋白增加。這些說明，5-Aza-CdR使RUNX3基因發生去甲基化，RUNX3基因重新表達，進而促使細胞的凋亡。

6 結論與展望

6.1 結論 5-Aza-CdR使膀胱癌5637細胞的生長受到抑制，細胞凋亡增加，可能是由于RUNX3基因的甲基化出現逆轉，RUNX3抑癌基因表達增加。檢測RUNX3基因可能有助于膀胱癌的早期發現，而RUNX3基因也可以作為膀胱癌基因治療的一個新參考靶點，5-Aza-CdR為膀胱癌的治療提供了一個可供參考的方向。

6.2 進一步工作的方向 基因的甲基化是一種由DNA甲基轉移酶(DNMT)介導的化學修飾過程，也是一個可逆的過程。因此，如果使腫瘤中因甲基化而失活的抑癌基因去甲基化，那么抑癌基因可能可以被重新激活，從而恢復其功能。那么，RUNX3基因的甲基化是否還可以通過其他藥物實現去甲基化，與5-Aza-CdR相比，效果如何，是否還有其他抑癌基因也有類似的情況，這些都值得深入研究。