中草藥對蛋雞腸道微生物多樣性和產蛋率的影響

邵志勇 楊文海 龔萍 何斌 吳利軍 陳潔 陳夏冰

摘要：以蛋雞品種北農1號為研究對象，在飼料中添加中草藥（B組）、中草藥+益生菌（C組），通過高通量測序分析蛋雞腸道細菌群落結構變化，并比較產蛋率。結果表明，添喂中藥的產蛋雞腸道細菌群落結構有明顯變化，細菌多樣性與不添加組比明顯降低，C組差異顯著;腸球菌屬、芽孢桿菌屬和梭菌屬微生物豐度均顯著增加，腸球菌屬豐度增加最為明顯;擬桿菌屬微生物豐度明顯降低。B組和C組的產蛋率均有明顯提高。可見中草藥和益生菌可改善腸道細菌群落結構，促進腸球菌屬在蛋雞腸道中定殖，有效提高蛋雞的生產性能。

關鍵詞：蛋雞;中草藥;益生菌;腸道群落結構;產蛋率

中圖分類號：S831.4? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）23-0145-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.035? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of Chinese herbal medicine on intestinal microbial diversity

and egg production rate of laying hens

SHAO Zhi-yong，YANG Wen-hai，GONG Ping，HE Bin，WU Li-jun，CHEN Jie，CHEN Xia-bing

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430083，China）

Abstract： Taking the laying hen variety Beinong No.1 as the research object， Chinese herbal medicine （group B）， Chinese herbal medicine + probiotics （group C） were added to the feed， and the bacterial community structure changes of the laying hens were analyzed by high-throughput sequencing， and the egg production rate were compared. The results showed that the intestinal bacterial community structure of laying hens fed with traditional Chinese medicine had obvious changes， and the ratio of bacterial diversity to non-added group was significantly lower， and the difference of group C was significant. The abundances of Enterococcus， Bacillus and Clostridium were significantly increased， and the abundance of Enterococcus was the most obvious. The abundance of Bacteroides was significantly reduced. The egg production rate of group B and group C was significantly improved. It can be seen that Chinese herbal medicine and probiotics can improve the intestinal bacterial community structure， promote the colonization of Enterococcus in the intestines of laying hens， and effectively improve the production performance of laying hens.

Key words： laying hen; Chinese herbal medicine; probiotics; intestinal microbial community structure; egg production rate

在規模化養殖中，抗生素被大量使用。抗生素濫用問題越來越受到人們的關注，替代物的研究越來越多。

益生菌是可有效改善動物腸道微生態環境，提高畜禽的抗病性、免疫力，提高生產性能，能替代抗生素的一種微生態制劑[1，2]。應用在畜禽養殖中的益生菌有芽孢桿菌類[3]（枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌等）、乳酸菌類[4]（植物乳桿菌、乳酸乳桿菌、乳酸片球菌、雙歧桿菌）、丁酸梭菌[5]和酵母類[6]（釀酒酵母、假絲酵母）等。這些益生菌可有效改善腸道微生態結構和微環境，促進有益菌的生長，提高畜禽的生產性能和免疫力[7-9]。

中國是中草藥的發源地，中草藥在畜牧業中的運用受到研究者的重視。中草藥、藥渣等均可作為飼料添加劑用于畜禽養殖，其作用可分為抗菌[10]、提高免疫力[11]、提高抗應激能力[12，13]、提高生產性能[14]、提高繁殖能力[15，16]、提高肉質[17，18]等。

本研究以北農1號蛋雞為研究對象，在常規飼料中添加中草藥和益生菌，研究其對蛋雞腸道細菌群落和生產性能的影響。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

蛋雞：北農1號。

常規蛋雞飼料：成分為玉米、小麥、麩皮、魚粉、豆粕、花生粕、磷酸氫鈣、石粉、復合維生素、蛋氨酸。

中草藥飼料：馬齒莧、生石膏、白頭翁、黃柏4種中草藥干燥粉碎后，過120目標準篩，然后按1∶1∶1∶1混合均勻。每噸常規蛋雞飼料添加10 kg。

中草藥+益生菌飼料：4種菌粉規格分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）10億/g;地衣芽孢桿菌（Bacillus Licheniformis）10億/g;糞腸球菌（Enterococcus Faecalis）2億/g;乳酸片球菌（Pediococcus Acidilactici）2億/g，按1∶1∶1∶1混合均勻，添加到中草藥飼料中，每噸添加1 kg。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 飼養? 將蛋雞分為3組，A組為飼喂常規蛋雞飼料的對照組，B組飼喂中草藥飼料，C組飼喂中草藥+益生菌飼料，每組100只。蛋雞在產蛋之前，一直飼喂常規飼料，從產蛋期開始（18周），B組和C組分別飼喂中草藥飼料和中草藥+益生菌飼料，對照組（A）保持不變。

1.2.2? 微生物測序? 飼養到27周時，取3組的糞便3個重復共9個樣品作為高通量測序的樣品。提取總DNA后，送上海派森諾生物科技有限公司進行細菌的高通量測序。選用250 bp細菌16S rRNA高度可變V4區測序。PCR 擴增16S rDNA V4區特異性引物為520F（5-barcode+AYTGGGYDTAAAGNG-3）、802R（5-TACNVGGGTATCTAATCC-3）。

1.2.3? 產蛋率測定? 按常規方法統計3個組在20、27、34、41周的產蛋率。

1.2.4? 統計分析? 通過QIIME計算菌群相對豐度和α多樣性。取評估指數包括ACE指數、Chao1指數、Simpson指數和Shannon指數。ACE指數和Chao1指數用于計算評估菌群相對豐度，Simpson指數和Shannon指數用于計算評估菌群多樣性。通過Shannon指數評估每個樣品微生物群落的生態多樣性。在門和屬2個分類水平上統計樣品的物種相對豐度和多樣性，對所取得OTUs數進行微生物豐度分析，利用SPSS 20.0進行單因素方差分析，將不同種類的主要細菌，在門、屬水平進行差異顯著性檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2? 結果與分析

2.1? α多樣性指數

所有樣品均得到覆蓋深度極深的測序數據。9個樣品共獲得352 221條高質量細菌序列用于分析。通過歸類分析，共獲得36 082個OTUs，所有OTUs通過與Greengenes的16S rRNA數據庫進行BLAST比較后確定其微生物分類。所獲OTUs主要歸類于7個菌門15個屬。ACE指數、Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數用于反映微生物群落的相對豐度和多樣性數據（表1）。從表1可知，飼喂中草藥組（B）與對照組（A）相比，α多樣性指數都有所降低，但無明顯差異，說明飼喂添加含中草藥的飼料對蛋雞腸道內的微生物多樣性指數影響不顯著。飼喂中草藥+益生菌組（C組）比對照組（A組）多樣性顯著降低。C組的α多樣性指數均比B組低，且部分指數存在顯著差異。

2.2? 門分類水平下腸道細菌結構

從門級分類進行腸道菌群結構分析，A組腸道微生物菌群主要歸屬于厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、擬桿菌門（Bacteriodetes）和放線菌門（Actinobacteria），占比分別為58.63%、5.40%、0.47%、30.93%和1.43%，其中厚壁菌門為蛋雞腸道內相對豐度最高的細菌。B組、C組厚壁菌門仍然是最主要的微生物，變化不明顯。變形菌門在B、C兩組中的豐度都顯著提高，而放線菌門的占比基本沒有變化。梭桿菌門在B組中的豐度為5.47%，顯著高于對照組的0.47%;而在C組中的豐度為2.37%，與對照組差異不顯著。擬桿菌門在A組中是豐度第二高的門類（30.9%），但B組的擬桿菌門下降至9.03%; C組僅為1.17%，與A組均差異極顯著。

2.3? 屬分類水平下腸道細菌結構

進行屬級分類水平分析，乳桿菌屬（Lactobacillus）A組豐度較高，占比21.87%，其次是擬桿菌屬（Bacteroides）等3個屬，均占比10%左右。B組、C組乳桿菌屬微生物的占比較低，為4.07%和2.37%，與A組差異顯著，不是主要屬。擬桿菌屬在3個組中的占比分別為10.53%（A組）、2.93%（B組）、0.3%（C組），差異顯著。梭菌科（Unclassified_Clostridiaceae）和消化鏈球菌科（Unclassified_Peptostreptococcaceae）兩個種屬的微生物在A組中占比較低（0.13%，0.77%），在B、C兩組都顯著提高;C組的提高量高于B組，B、C組之間差異不顯著。腸球菌屬（Enterococcus）在A組未檢出，但B、C組中均出現，占比分別為2.27%（B組）和2.47%（C組），與A組差異顯著。梭菌屬（Clostridium）和芽孢桿菌屬（Bacillus）占比差異較大，組間差異顯著。

2.4? 產蛋率

分別監測3個組在產蛋期的產蛋率，結果如表2所示。從表2可看出，B、C兩個組的蛋雞，在產蛋高峰期（27～34周），平均產蛋率維持在93%～94%，比對照組高3個百分點左右，且C組產蛋率略高于B組，但無顯著差異。

3? 小結與討論

飼喂中草藥和中草藥+益生菌，蛋雞腸道微生物多樣性降低，飼喂中草藥+益生菌比單獨飼喂中草藥降低更顯著。說明中草藥和益生菌能改變蛋雞腸道細菌群落的多樣性，兩者配合效果更明顯。

研究中草藥和益生菌對蛋雞腸道細菌群落結構的影響。厚壁菌門是蛋雞腸道占比最高的門類，飼喂中草藥和益生菌對其影響較小，梭菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬等常用的腸道益生菌都屬于此門類。影響不大的還有放線菌門，但其占比較低。擬桿菌門的影響顯著，占比明顯降低。擬桿菌門種屬有較多致病菌，飼喂中草藥和益生菌后，其占比降低有利于減少發病。

飼喂中草藥和中草藥+益生菌，蛋雞腸道芽孢桿菌屬占比提高2～5倍，其中飼喂中草藥+益生菌組提高更為顯著。芽孢桿菌屬中的枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等是常用的腸道益生菌，可抑制致病菌的生長，減少畜禽發病率，提高生產性能[19-21]。差異更大的是腸球菌屬微生物。在對照組未檢出腸球菌屬，在B、C組中占比較多。腸球菌屬在飼喂的4種益生菌中的用量比芽孢桿菌屬低一個數量級，但是蛋雞腸道占比比芽孢桿菌屬的占比高5～7倍，說明中草藥可促進腸球菌屬的定殖。在飼喂的4種常用益生菌中，乳酸片球菌所屬的片球菌屬（Pediococcus）沒有檢出，說明乳酸片球菌難以在腸道有效定殖，中草藥對其定殖沒有明顯作用。梭菌屬微生物是能形成芽孢、厭氧生長的革蘭氏陽性細菌，該屬的丁酸梭菌是公認的腸道益生菌[20]。梭菌屬占比在飼喂中草藥組提高了10倍以上，且飼喂中草藥+益生菌組的占比顯著高于只飼喂中草藥組，說明中草藥促進梭菌屬的定殖，中草藥和益生菌共同作用效果更佳。飼喂中草藥和益生菌能使蛋雞腸道菌群結構得到有效調整。

金順義等[22]研究表明益生菌發酵中草藥可有效提高母豬生產性能，顯著提高血清中催乳素含量。在本研究中，蛋雞的生產性能也有明顯提高。一般白殼蛋雞的產蛋率高峰期為90%左右，持續時間較短，但是飼喂中草藥和益生菌后，蛋雞在高峰期的產蛋率提高至94%左右，且能夠保持較長的時間，說明這兩種添加物在改善蛋雞腸道后，可有效提高蛋雞的生產性能。

通過高通量測序分析可發現，中草藥和益生菌可有效地改善蛋雞腸道中菌群結構，促進芽孢桿菌屬和腸球菌屬微生物的定殖，減少潛在發病率。這兩種添加物的組合可有效提高蛋雞的生產性能，可為減抗限抗及抗生素替代物的研究提供數據支撐。

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