Ｃｅｐ１６４基因缺失對小鼠胚胎早期腦發育的影響

摘要：利用Foxg1、Gbx2、Otx2、Fgf8和En1探針與小鼠胚胎進行原位雜交，分析Foxg1、Gbx2、Otx2、Fgf8和En1基因在Cep164基因缺失小鼠胚胎腦中的表達情況，確定Cep164基因對腦發育的影響。結果顯示，與野生型相比，Cep164基因突變小鼠胚胎頭部Gbx2、前中腦Otx2和中后腦的邊界Fgf8表達無明顯變化，但端腦泡Foxg1表達減少，前神經脊Fgf8表達減少，Otx2在晶狀體板和嗅狀體板表達減少，背側中腦和后腦前En1表達減少。這說明Cep164基因是維持胚胎頭部正常發育的重要基因，Cep164基因突變會導致前腦發育異常，主要影響嗅覺和視覺功能。

關鍵詞：Cep164;基因缺失;小鼠胚胎;腦發育;原位雜交

中圖分類號：S852.2? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）23-0139-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.033? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of Cep164 gene deletion on embryonic mouse brain development

WANG Chun-hua

（School of Life Science and Technology，Mudajiang Normal University，Mudanjiang 157000，Heilongjiang，China）

Abstract： To reveal the function of Cep164 gene in mouse brain development， the expression level of Foxg1，Otx2，Gbx2，Fgf8 and En1 in embryonic brain with Cep164 gene deletion was detected by in situ hybridization experiment. The results showed that the expression of Gbx2 and Otx2 in the brain， and Fgf8 in the midbrain-hindbrain boundary， were no significant change in the Cep164 mutation embryonic mice， compared with wild type. But the expression of Foxg1 in telencephalic vesicles， the Fgf8 in anterior neural ridge， the Otx2 in eye and olfaction plate， and En1 in ventral midbrain and anterior hindbrain decreased. The all results reveal Cep164 is an important gene to maintain the normal brain development. Cep164 gene mutation could cause forebrain dysplasia， mainly affect olfaction and vision.

Key words： Cep164; gene deletion; embryonic mouse; brain development; in situ hybridization

Cep164是中心體激活元件Cep家族的一員，位于母中心粒基體末端，參與纖毛的形成過程[1]。研究人員通過siRNA技術沉默細胞中Cep164基因，證明當Cep164基因突變時會導致細胞中纖毛缺失[2]。Moumita等[3]在對纖毛相關腎消耗病患者的基因分析時發現，患者的Cep164基因發生純合子點突變。通過斑馬魚試驗發現，當Cep164基因突變時斑馬魚發生腎消耗病（Nephronophthisis-related ciliopathies，NPHP-RC），表型包括腎小管囊腫、腦積水和視網膜發育不良[3]。但關于哺乳動物的突變表型并未見相關報道。在前期試驗中發現Cep164基因突變會導致胚胎發育異常，表型包括胚胎發育遲緩、心臟外膜增大擴張、血管發育不良、背側神經管不對稱發育、胚胎軀體異常彎曲、面部前脊神經管不閉合、頭部神經管閉合不全、心臟反向扭轉彎曲[4]。由于Cep164基因突變導致胚胎存活不到14.5 d，腦發育的表型并未觀察到。本研究利用原位雜交技術對小鼠胚胎腦部發育中特異性基因En1、Otx2、Foxg1、Fgf8和Gbx2的表達與分布進行檢測，一方面利用基因在胚胎腦發育過程中特定位置來確定Cep164基因對腦發育的影響，另一方面推測Cep164基因對腦發育的影響機制。

1? 材料與方法

1.1? 材料

Cep164基因敲除雜合子小鼠（Cep164+/-）饋贈于美國康奈爾大學。Cep164基因敲除雜合子雌鼠（Cep164+/-）與Cep164+/-雄鼠進行雜交，以合籠次日雌鼠見陰栓記為懷孕0.5 d（E0.5），在E10.5采用頸椎脫臼法處死懷孕母鼠，根據基因型檢驗獲得E 9.5的Cep164-/-與野生型（WT）胎鼠。

1.2? 探針準備

參照Graser等[1]的方法合成 En1、Otx2、Fgf8、Foxg1和Gbx2基因探針。采用5組引物（表1），選用巢式PCR分別擴增目標基因，純化PCR產物經BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切，連接PBS-SK質粒，轉化大腸桿菌感受態細胞挑取單克隆，獲得的重組質粒經測序確認序列無誤及判斷插入方向后，采用BamH Ⅰ將Bs-En1、Bs-Otx2、Bs-Fgf8和Bs-Foxg1重組質粒線性化，EcoR Ⅰ將Bs-Gbx2重組質粒線性化。如圖1所示，以線性化片段為模版用T3或T7 RNA聚合酶體外轉錄合成帶地高辛（DIG）標記的En1、Otx2、Fgf8、Foxg1和Gbx2基因探針。分別取1 μL反應物，用葡聚糖凝膠電泳進行探針檢測。

1.3? 原位雜交

將E10.5胚胎用4%多聚甲醛固定后在4 ℃條件下過夜，經甲醇梯度脫水，復水后，0.2%戊二醛再固定胚胎，參考Martinez-Barbera等[5]的方法，用En1、Otx2、Fgf8、Foxg1和Gbx2探針進行胚胎頭部的原位雜交。

2? 結果與分析

2.1? En1、Otx2、Foxg1、Fgf8和Gbx2原位雜交探針

如圖2所示，1 μL反應物的葡聚糖凝膠電泳結果顯示，En1、Otx2、Foxg1、Fgf8和Gbx2的條帶位置均與擴增目標條帶位置相同，分別為1 040、1 000、820、820、820 bp，并且反應效率高，濃度足夠作為探針與胚胎進行原位雜交。

2.2? Cep164-/-胚胎前腦發育異常

正常胚胎頭部發育中，Foxg1表達在端腦泡（Telencephalic vesicle），如圖3A所示。與其相比，圖3a中，Cep164-/-小鼠胚胎頭部Foxg1的表達范圍減少，說明Cep164突變導致小鼠胚胎端腦泡體積減小。

正常胚胎頭部發育中，Gbx2表達在中后腦邊界區域（Mid-hind brian boundary，MHB），如圖3B所示。與其相比，圖3b中，Cep164-/-小鼠胚胎頭部Gbx2的表達不變。

正常胚胎頭部發育中，Otx2表達在晶狀體板、嗅基板、前腦中腦區域，如圖3C所示。與其相比，圖3c中，Cep164-/-小鼠胚胎Otx2在晶狀體板和嗅基板減少，在前腦中腦區域表達正常。

正常胚胎頭部發育中，En1表達在背側中腦和后腦前，如圖3D所示。與其相比，圖3d中，Cep164-/-小鼠胚胎背側中腦和后腦前En1表達減少。

正常胚胎頭部發育中，Fgf8表達在中后腦邊界區域和前神經脊（Anterior neural ridge，ANR），如圖3E和圖3F所示。與圖3E相比，圖3e中，Cep164-/-小鼠胚胎頭部中后腦邊界區域表達范圍無明顯變化。與圖3F相比，圖3f中，Cep164-/-小鼠胚胎前神經脊表達范圍明顯減少。

3? 討論

在脊椎動物中，中腦和后腦邊界提供了中腦和后腦喙部模式形成的基本組織信號。通過Otx2和Gbx2基因的表達可確定MHB最終位置，Otx2和Gbx2基因可激活MHB特異性基因Fgf8，Otx2或Gbx2基因的缺失不能抑制MHB的形成，但能改變MHB位置和Fgf8的表達區域，Otx2基因缺失可導致MHB向喙部移動，而Gbx2基因缺失導致MHB向尾部移動，當小鼠Otx2和Gbx2基因同時失活，Fgf8的表達完全正常，但表達區域變大，說明Fgf8的表達不依賴于這兩個基因[5]。本研究發現，Cep164基因突變對胚胎頭部發育中Gbx2表達在MHB和Otx2在前腦、中腦區域表達正常，Fgf8在頭部中后腦邊界區域表達范圍也無明顯變化，說明Cep164對MHB的形成位置和面積均無影響。

Oxt2在鼠胚胎發育過程中，除了在前腦、間腦的神經外胚層表達外，還在晶狀體板表達[6]，與Pax6.0共同調節控制視網膜上皮色素細胞的轉分化及再生視網膜細胞的分化[7]。試驗結果顯示，Cep164基因突變導致晶狀體板和嗅基板Otx2表達減少，說明Cep164基因的缺失影響了視覺和嗅覺正常功能的發育，Cep164基因突變可能會導致小鼠視覺和嗅覺功能障礙，這也是纖毛病變的表型之一。Fgf8是前腦發育過程中至關重要的信號分子[8，9]，除了表達在中后腦邊界區域，還在前神經脊表達，試驗結果顯示Cep164突變小鼠前神經脊Fgf8表達范圍明顯減少，Cep164基因突變小鼠的前腦小于野生型胚胎，這可能是Cep164基因突變導致小鼠胚胎前腦發育異常的原因之一。特異性表達在端腦泡的Foxg1基因對前腦正常發育也至關重要，Foxg1在Cep164基因突變小鼠胚胎中表達減少，端腦泡體積減小，此結果與Fgf8結論一致，進一步說明Cep164基因與胚胎前腦正常發育相關。

參考文獻：

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