生物膜、毒力基因和耐藥基因對ＡＰＥＣ的致病性作用

盧琴 羅青平 張騰飛 羅玲 汪宏才 王紅琳 溫國元 張蓉蓉 張文婷 邵華斌

摘要：禽致病性大腸桿菌病（Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC）是危害養禽業發展的主要細菌性病原之一，給養禽業的發展帶來了嚴重危害。為研究APEC的致病性與耐藥性之間的關系，從毒力基因的分布、生物膜的形成能力、耐藥基因的分布等三個方面探討了生物膜的形成能力與毒力基因、耐藥基因在致病性中的作用，為后期研究禽大腸桿菌的致病機理及耐藥機制等提供理論基礎，并為開展禽大腸桿菌病的流行病學調查及監測、防控禽大腸桿菌病的流行提供理論數據。

關鍵詞：禽致病性大腸桿菌病（Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC）;生物膜;毒力基因;耐藥基因;致病性

中圖分類號：R378.2+1? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）23-0132-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.031? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Pathogenic effects of biofilm，virulence genes and drug resistance genes on APEC

LU Qin，LUO Qing-ping，ZHANG Teng-fei，LUO Ling，WANG Hong-cai，WANG Hong-lin，

WEN Guo-yuan，ZHANG Rong-rong，ZHANG Wen-ting，SHAO Hua-bin

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Hubei Academy of Agricultural Scinences/Key Laboratory of Prevention and Control Agents for Animal Bacteriosis，Wuhan 430064，China）

Abstract： Avian Pathogenic Escherichia coli （APEC） is one of the major bacterial pathogens that endangers the development of the poultry industry， and has brought serious harm to the development of the poultry industry. In order to study the relationship between pathogenicity and drug resistance of APEC，the distribution of virulence genes， the biofilm formation ability and the distribution of drug resistance genes were discussed from three aspects，which were the distribution of virulence gene， the ability of biofilm formation and the distribution of drug resistance gene. The results provided a theoretical basis for the later study of the pathogenic mechanism and drug resistance mechanism of avian Escherichia coli， and carried out epidemiological investigation and surveillance of avian colibacillosis， and provided theoretical data for the prevention and control of avian Escherichia coli.

Key words： APEC; biofilm; virulence genes; drug resistance genes; pathogenicity

禽致病性大腸桿菌（Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC）是引起雞、火雞及其他禽類局部或全身性大腸桿菌病的病原，病理表現為心包炎、肝周炎、腹膜炎、氣囊炎、卵巢輸卵管炎、滑膜炎和敗血癥等癥狀，是目前嚴重危害養禽業的傳染病之一[1]。1885年德國小兒科醫師Escherich自小兒糞便首次發現大腸桿菌;1894年，Ligniers首次報道了雞大腸桿菌病，中國自1982年江蘇省首次報道該病以來，目前幾乎所有養禽區地均因感染禽致病性大腸桿菌造成不可忽視的經濟損失[2]。

研究表明大腸桿菌的致病性與特定的血清型、噬菌體、耐酸堿能力、攝鐵、生物膜的形成能力等有關，而致病性強的菌株由于在臨床中耐藥性提高，嚴重影響中國養殖業的可持續健康發展。而耐藥性增強與生物膜的形成能力、毒力基因、耐藥基因均具有相關性。

1? 生物膜與APEC致病性的關系

細菌生物膜（Bacterial biofilms）又稱為生物膜，是單細胞生物體粘附在固體表面聚集為一個群落，分泌多糖蛋白、纖維蛋白、脂質蛋白等，將自身包裹其中。細菌生物膜已經被證明在許多細菌中存在，包括大腸桿菌、豬鏈球菌、嗜血桿菌和鴨疫里默氏桿菌等[3]。Lewis[4，5]經過長期研究發現生物膜與細菌的耐藥性相關，當細菌存在于生物膜內，對抗菌劑的抵抗能力顯著增強。主動外排系統是指大腸桿菌細胞內膜存在的能量依懶性蛋白質外排泵，通過主動外排作用，可將藥物從菌體內排出，使到達作用靶位點的藥量減少，不足以發揮殺菌和抑菌作用。由主動外排系統介導，阻止藥物在菌體內積聚是細菌產生多重耐藥性的機制之一。OmpA參與合成外膜蛋白，與禽大腸桿菌的致病性有密切聯系，上述研究結果與國內外對APEC的毒力基因檢測結果一致[6，7]。大腸桿菌的外膜對許多抗生素的通透性較低，形成屏障，阻礙抗菌藥物進入菌體細胞內發揮抗菌作用。大腸桿菌外膜上存在的多種外膜蛋白質，對大多數疏水性藥物具有良好的通透性。生物膜陽性菌株的致病力強于生物膜陰性菌株，這為臨床預防仔豬腹瀉病提供了理論依據[8]。生物膜是威脅人類健康的殺手之一，根據CDC統計人類約65%的細菌感染性疾病與生物膜形成有關，也有研究認為約80%的細菌性疾病與生物膜有關[9，10]。細菌一旦形成生物膜，其耐藥性可增強100～1 000倍，能夠抵抗機體免疫力和抗生素的侵害引起反復感染，大腸桿菌能在口腔、尿道、生殖道、腸道形成生物膜導致反復感染[11-13]。

2? 毒力基因與APEC致病性的關系

大腸桿菌的致病性與毒力基因的關系已成為國內外研究熱點。Germon[14]、Huang[15]研究ibeA基因對APEC的毒力作用，結果證明，敲除APEC-BEN2908菌株中的ibeA基因能導致毒力明顯下降。Kmet等[16]研究白嘴鴉大腸桿菌的致病性和耐藥性，結果表明與致病性相關的毒力因子為iutA、cvaC、iss、tsh、ibeA基因，內酰胺類耐藥基因主要為CTX-M、CMY，喹諾酮類耐藥基因為qnrS、integrase1等，對氨芐西林、鏈霉素、環丙沙星呈現不同程度的耐藥。Mohamed等[17]對肉雞大腸桿菌的毒力因子和耐藥性關系研究，得出其主要的毒力因子為tsh、papC、colV和iss基因，96%的試驗菌株對諾氟沙星高度耐藥。Maud等[18]研究表明ibeA能增加大腸桿菌對H2O2的抵抗力，能部分解釋ibeA在致病性菌株毒力的作用。喻華英等[19]證實細菌粘附結構fimH基因和fliC基因是影響大腸桿菌形成生物膜的主要粘附結構毒力基因，其次是大腸桿菌毒力因子KpsMTII基因，最后是外膜蛋白血紅素chuA基因。95%的大腸桿菌分離株可表達I型菌毛。fimH基因（Type 1 fimbria）為編碼1型菌毛粘附素基因，其作用為大腸桿菌菌毛介導結合受體結構，使細菌侵入各種宿主組織[20，21]。FliC是編碼鞭毛絲結構蛋白基因，是鞭毛組成的基本亞基，能形成大腸桿菌的鞭毛結構[22]。高清清[23]、Gao等[24]對SPF雞致病試驗表明，介導沙門菌素攝鐵的iroD基因和編碼氣桿菌素合成的iucD基因與APEC和UPEC致病性有較強的相關性。Lise等[25]證明敲除掉mliC基因后APEC菌株的毒力下降。iss基因存在于ColV質粒上，其編碼的蛋白iss屬于外膜蛋白的一部分，與細菌抗補體作用有關，可增強大腸桿菌血清抗性[26，27]。iss在APEC中的檢測率更高，其可能是APEC的一個重要致病因子[28，29]，促使APEC能夠在宿主體內迅速增殖。

3? 耐藥基因與APEC致病性的關系

對于大腸桿菌病的治療，一般采用β-內酰胺類、喹諾酮類、四環素類及磺胺類藥物，故本研究以β-內酰胺類、喹諾酮類、四環素類及磺胺類藥物的主要耐藥基因（β-內酰胺類TEM、CTX-M，四環素類tetA、tetB，喹諾酮類gyrA、gyrB，磺胺類sul1、sul2）進行研究，探討APEC毒力因子的致病作用是否與耐藥基因所占比重相關。武瑞兵等[30]根據耐藥表型檢測了耐四環素菌中tetA、tetB和tetC基因，結果表明tetA基因是所有四環素耐藥基因中最為流行的一種基因（占55%）;耐磺胺類藥菌中sul1、sul2和sul3基因中sul2基因在耐磺胺異惡唑菌中的檢出率最高（占77%）;β-內酰胺類藥物耐藥基因中最流行的為TEM1基因（占73%）。四環素耐藥性主要由tetA和tetB基因編碼，這一發現已經在分離自畜牧業生產和食用動物的大腸桿菌中被證實[31]。張揚等[32]的研究表明tetA和tetB基因也幾乎均勻地分布于15個ERIC型菌株中，說明tetA和tetB基因在菌株間主要是水平傳播。肺炎克雷伯菌對喹諾酮類耐藥與多種基因突變相關，最主要的是gyrA基因突變[33]。目前已發現的喹諾酮類抗生素的耐藥基因主要包括gyrA、gyrB、qnrA1、qnrB、qnrS1、qeqA和aac（6，）Ib-Cr等[34-36]。有研究表明，動物源性磺胺類耐藥基因sulR（sul1、sul2、sul3）很有可能轉移到人的共生菌大腸桿菌中，并引起泌尿道感染[37]。有研究表明sul1與Ⅰ型整合子高度相關，近年來Ⅰ型整合子的檢出率不斷上升，整合子在細菌間的轉移又十分頻繁和廣泛，不僅可以在同種細菌間轉移，還在不同種細菌間轉移，sul1則通過整合子在菌群間傳播[38]。sul2主要位于質粒上，質粒作為可移動元件在細菌間轉移也十分頻繁，sul2隨著質粒的轉移而向外傳播。有研究表明sul1和sul2在磺胺類耐藥菌株的產生中起重要作用[39-41]。細菌對β-內酰胺類抗生素產生耐藥性主要機理是其產生β-內酰胺酶和超廣譜β-內酰胺酶（Extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）編碼ESBLs的基因位于細菌攜帶的質粒上，常參與細菌的多重耐藥。現已發現的ESBLs基因主要包括TEM、SHV、CTX-M、OXA和其他型等[42]。Paterson等[43]的研究表明有75株受試菌種有57株擴增出TEM型基因，29株擴增出CTX-M型基因。中國已報道的基因型包括CTX-M-14、CTX-M-64、TEM-1型和SHV-2等，不同基因亞型菌株間的耐藥性差異及耐藥基因傳播機制等還需進一步研究[44，45]。

在后期的試驗中可結合特定的血清型、毒力基因的類型、鐵離子攝取系統、噬菌體、生物膜的形成能力、動物試驗和耐藥基因及藥敏試驗等去探討致病耐藥性增強與特定的血清型有沒有相關性，毒力基因的分布及研究中的哪種毒力基因在致病耐藥性中占主導作用，為全面闡明APEC毒力基因的致病機理和耐藥機制提供理論基礎。

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