響應面法優化貝萊斯芽孢桿菌ＣＹ３０發酵培養基的研究

劉芳 廖先清 周榮華 陳偉 饒犇 黃大野

摘要：為了對貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）CY30的發酵培養基進行優化以提高芽孢產量，應用Plackett-Burman設計法對影響貝萊斯芽孢桿菌CY30芽孢形成的關鍵因子進行篩選，通過最陡爬坡路徑法確定主要影響因素的響應中心點，并進一步采用中心組合設計和響應面分析法確定最優培養基。結果表明，該菌株芽孢產量的關鍵影響因素為甘薯粉和酵母膏的濃度。通過響應面分析法的擬合和推算得到，甘薯粉和酵母膏濃度分別為37.35 g/L和15.29 g/L時，模型預測發酵最佳產量為91.2億CFU/mL，驗證值為97.5億CFU/mL，預測值與驗證值之間吻合較好，比優化前實際產量（63.8億CFU/mL）提高了53%。

關鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）CY30;發酵培養基;優化;芽孢數;響應面法

中圖分類號：Q939.92? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）23-0091-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.021? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on optimization of fermentation medium of Bacillus velezensis CY30

by using response-surface method

LIU Fang，LIAO Xian-qing，ZHOU Rong-hua，CHEN Wei，RAO Ben，HUANG Da-ye

（Hubei Biopesticide Engineering Research Centre，Wuhan 430064，China）

Abstract： To optimize the fermentation medium of Bacillus velezensis CY30 for enhancing the spore counts in the fermentation broth， the key factors among the media components were investigated by using Plackett-Burman（PB） design. The central axises of these factors were determined by using steepest-ascent method. The optimized medium for Bacillus velezensis CY30 was determined by central combination design and response surface method. The results demonstrated that the key factors influcening the spore counts in fermentation broth were sweet potato powder and yeast extract. The optimized medium was obtained through response surface analysis was 37.52 g/L of sweet potato powder， 15.29 g/L of yeast extract. The estimated maximum spore counts was 9.12 billion CFU/mL， while the real spore counts was 9.75 billion CFU/mL in shake-flask fermentation. The spore counts of the fermentation broth with optimized medium was 53% higher than that before the optimization（6.38 billion CFU/mL）.

Key words： Bacillus vezelensis CY30; fermentation medium; optimization; spore count; response-surface method

芽孢桿菌（Bacillus）廣泛存在于自然界，是重要的農作物病蟲害生物防治因子，并廣泛開發為活體微生物農藥，用于農作物病蟲害的防治[1]。作為芽孢桿菌屬中的一種，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）最早由Ruiz-Garcia等[2]從采自西班牙貝萊斯河的水樣中分離獲得，可產生表面活性劑。后續研究者從不同的生態環境中分離到貝萊斯芽孢桿菌，并發現其對多種植物病原真菌、黃單胞菌及馬鈴薯瘡痂病菌等具有抑菌活性[3]。貝萊斯芽孢桿菌還可用作絮凝劑、食品發酵劑，并用于表面活性劑的生產[3]。筆者所在研究團隊在前期的研究中從茶樹根際土壤中分離到貝萊斯芽孢桿菌CY30菌株，其對多種植物病原真菌具有較強的抑菌活性，并對茶輪斑病具有一定的防效，表明其具有一定的開發價值。通過對貝萊斯芽孢桿菌CY30發酵培養基的優化，提升該菌株的發酵水平，可加快該菌株的產業化進程。

不同的微生物對營養的需求各不相同，在微生物工業化生產之前，必須要對其發酵培養基及培養條件進行優化。微生物發酵培養基的優化方法種類眾多，其中以響應面法能夠快速有效地確定發酵培養基的組成及培養條件。本研究以自主分離獲得的貝萊斯芽孢桿菌CY30菌株為研究對象，對其培養基配方進行Plackett-Burman試驗，篩選顯著的影響因子，然后通過中心組合設計和響應面分析，獲得最優培養基組合，以期為該菌株的擴大生產及產業化發展提供支撐。

1? 材料與方法

1.1? 供試菌株

貝萊斯芽孢桿菌CY30菌株由湖北省生物農藥工程研究中心從湖北省恩施土家族苗族自治州鶴峰縣茶園根際土壤分離得到并保存于武漢大學中國典型培養物保藏中心，菌種保藏編號為CCTCC M2018710。

1.2? 供試培養基

供試培養基的組成：①LB瓊脂培養基。胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，酵母提取物5 g，瓊脂粉20 g，去離子水1 L，pH 7.0。②種子培養基。LB液體培養基，500 mL 三角瓶裝液量為100 mL。③初始發酵培養基。淀粉15 g，豆粕20 g，碳酸鈣1.0 g，硫酸鎂0.3 g，磷酸二氫鉀0.1 g， 去離子水1 L，pH 7.5，500 mL三角瓶裝液量為50 mL。

1.3? 搖瓶培養

斜面菌種30 ℃活化后接種一環入LB液體培養基中，在溫度30 ℃、搖床轉速180 r/min條件下培養16 h，按2%（V/V）接種量再接入到發酵培養基中搖床培養到芽孢脫落分離20%時停止。

1.4? 芽孢數的測定

培養結束后發酵液芽孢數采用稀釋涂布平板計數法測定，稀釋液涂布LB平板前置于80 ℃水浴20 min。

1.5? 試驗方法

1.5.1? Plackett-Burman設計? 采用Minitab的Plackett-Burman兩水平法對培養基成分進行考察，篩選影響生物量和芽孢產量的重要因素，確定最佳配方。

1.5.2? 最陡爬坡試驗? 根據Plackett-Burman試驗得出的擬合方程安排最陡爬坡試驗來確定因素取值中心點。擬合方程中各變量系數確定爬坡方向和變化步長，另外步長確定亦與試驗條件相關。

1.5.3? 中心組合設計和響應面分析? 對Plackett-Burman試驗確定的因素以最陡爬坡試驗得到的中心點，根據中心組合設計原理安排響應面試驗獲得重要因素的最佳配方水平。根據中心組合設計結果來擬合數據，得到描述響應值和自變量之間關系的二階模型，即：

式中，Y是產物能力測量值，X為因素，b0是截距，bi、bj是關鍵因素i、j線性效果的系數，bii是關鍵因素的二次效應的系數，bij是關鍵因素間交互作用的系數。

根據擬合的數學模型以及方差分析的結果可以評價每個因子及其交互作用對過程的影響程度，利用響應面圖和等高線圖直觀地描繪其結果，同時利用擬合的數學方程求解最優結果。

1.5.4? 培養基優化結果的驗證試驗? 用優化后的培養基組分配制發酵培養基，搖瓶發酵結束后測定發酵液的芽孢數。

1.5.5? 200 L罐發酵? 用優化后的培養基組分配制發酵培養基，投料體積120 L，消泡劑0.2%，滅菌前pH 7.5，1×105 Pa滅菌30 min。待溫度降至32 ℃時接入1%（V/V）的種子液，通氣比1∶（0.5～1.2），罐壓0.5×105 Pa，培養溫度30～32 ℃，攪拌常開。發酵過程中取樣鏡檢，芽孢脫落分離20%時結束發酵，發酵液在5 000 r/min條離心10 min，棄部分上清液，得到3倍濃縮液，濃縮液真空冷凍干燥得到凍干粉，測定發酵液和凍干粉的芽孢數。

2? 結果與分析

2.1? Plackett-Burman試驗設計

根據前期單因素試驗結果，確定以甘薯粉為碳源（X1），以花生粕（X2）、酵母膏（X3）、工業蛋白胨（X4）為氮源，共4種因素一起進行Plackett-Burman設計試驗，設計方案和試驗結果見表1。

由檢驗結果（表2）t可知，甘薯粉和酵母膏對CY30的生長和芽孢形成有顯著影響，可信度在90.70%以上，且兩者對芽孢形成的影響是正效應。

由表2得到的回歸方程如下：

Y=60.650+11.117X1-1.983X2+5.850X3+0.483X4

方程擬合的相關性R2=96.74%，表明此方程能很好地模擬和解釋Plackett-Burman的試驗結果。

2.2? 最速爬坡試驗

找到對產物發酵影響最大的因素后，需要進一步地對這些因素進行分析。最常用的分析方法就是響應面分析，但該方法是一種局部的分析方法，是在一定范圍內根據試驗求得最優解。所以在進行響應面分析試驗前首先應當通過試驗找到最優值附近的區域，在此區域內再進行響應面試驗。

利用最速上升法試驗可以實現這樣的目的，最速上升法以前述Plackett-Burman設計試驗得到的一次方程為基礎，以相應因素的系數比為基準進行步移，直到步移至最高點，然后以最高點附近的范圍作為響應面優化的相應范圍。從Plackett-Burman設計試驗所得方程中甘薯粉和酵母膏的系數（X1為11.117，X3為5.850）可算得這兩個因素步移的步長比為1∶0.526，即當甘薯粉步移1個單位（5 g/L）時，酵母膏步移0.526個單位（2.63 g/L）。以Plackett-Burman設計中的中心點（甘薯粉為25 g/L;酵母膏為10.00 g/L）作為步移的起點，試驗設計與結果如表3所示。由表3可知，開始時CY30芽孢產量隨著甘薯粉與酵母膏的升高而增加，在步移進行至第三步時達到最高點，之后CY30芽孢產量開始下降。步移最高點時甘薯粉與酵母膏的濃度分別為35 g/L和15.26 g/L，這一點被用作下一步響應面分析的中心點。

2.3? 中心組合設計試驗及響應面分析

由Plackett-Burman試驗可知，影響CY30芽孢產量的兩個重要因素分別是甘薯粉與酵母膏。根據中心優化組合方法，設計了2因素5水平的響應面分析（RSA），試驗設計見表4，共13組試驗。

以甘薯粉和酵母膏為自變量，以CY30菌株產生的芽孢數（Y）為響應值，根據分析結果得到的二次多項式回歸方程為：

Y=-84.660+4.817X1+2.842X2-1.455X12+2.120

X22-3.025X1X2

利用Minitab軟件對回歸模型進行響應面分析，考察所擬合響應面的形狀，得到各響應面立體分析圖和相應等高圖，見圖1和圖2。由圖及軟件分析可知該模型具有最大值，利用Minitab軟件響應優化器進行計算可得，最大值處X1=37.35 g/L，X2=15.29 g/L，在此條件下理論預測得到CY30菌株產生的芽孢數為91.2億CFU/mL。

2.4? 最佳培養基的驗證

為了確定試驗結果的可靠性，對上述優化培養基進行了驗證試驗，共做3組平行試驗，CY30芽孢桿菌的芽孢數為97.5億CFU/mL，與預測值十分接近，比優化前實際產量（63.8億CFU/mL）提高了53%。

2.5? 200 L罐發酵

發酵周期36 h，發酵28 h時取樣鏡檢，芽孢形成率為98%，菌體大小整齊;放罐時取樣鏡檢，約20%芽孢脫落，芽孢整齊。發酵液芽孢數為120億CFU/mL，較搖瓶發酵提升了30%以上。利用200 L發酵罐發酵液制備的凍干菌粉的芽孢數為31.2億CFU/g。

3? 討論

芽孢數是芽孢桿菌生防菌劑的一個重要質量指標，而芽孢的產生受到培養基的組成及培養條件的影響。本研究表明，影響芽孢桿菌 CY30菌株產生芽孢的關鍵因素為甘薯粉與酵母膏，通過優化獲得CY30菌株最佳培養基配方為甘薯粉37.35 g/L、花生粕15.00 g/L、酵母膏15.29 g/L、工業蛋白胨15.00 g/L、碳酸鈣1.00 g/L、硫酸鎂0.30 g/L、磷酸二氫鉀0.10 g/L、pH 7.5。甄新武等[4]的研究表明，芽孢桿菌Z-27菌株的優化培養基為玉米粉2.0%、豆餅粉1.5%、 MnSO4·H2O 0.07%，在最適條件下的發酵水平約為20億芽孢/mL。李姝江等[5]通過優化獲得了芽孢桿菌 ZJ-20菌株的發酵培養基和培養條件，在最適條件下的發酵水平為7.69×109芽孢/mL。楊可等[6]利用響應面法對芽孢桿菌TCS001菌株的發酵培養基進行了優化，獲得了優化培養基組成為蛋白胨10.0 g/L、葡萄糖12.5 g/L、牛肉浸膏4.0 g/L、酵母粉1.0 g/L，大幅提升了發酵液對黃瓜灰霉病菌病斑的抑制率。本研究所得培養基組成與他們的研究存在明顯的差異，表明不同來源的芽孢桿菌菌株的營養需求不相同，而且發酵水平也存在較大差異。

對植物病原菌具有拮抗活性的芽孢桿菌菌株通過產生脂肽[7]、揮發性抑菌物質[8]、葡聚酶[9]或抑菌蛋白[10]等來抑制病原菌的生長。本研究僅針對芽孢數來對發酵培養基進行優化，獲得了高產芽孢的培養基優化配方。但培養條件，包括轉速、溶氧、pH及發酵溫度對芽孢的形成及抑菌活性物質的產生影響也較大。下一步還要結合CY30菌株所產生的抑菌活性物質對培養基及培養條件作進一步的優化，為該菌株的工業化生產提供技術支撐。

參考文獻：

[1] 王? 春，汪? 琨，崔志峰.芽孢桿菌活體微生物農藥研究現狀及應用[J].浙江農業科學，2013（7）：830-834.

[2] RUIZ-GARCIA C，BEJAR V，MATINEZ-CHECA F，et al. Bacillus velezensis sp. nov.，a surfactant-producing bacterium isolated from the river Velez in Malaga，southern Spain[J].Intl J Syst Evol Microbiol，2005，55（1）：191-195.

[3] 張彩文，程? 坤，張? 欣，等.貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）分類學及功能研究進展[J].食品與發酵工業，2019，45（17）：258-265.

[4] 甄新武，喬均儉.BP神經網絡結合正交試驗法優化Bacillus? velezensis Z-27菌株培養基組分[J].湖北農業科學，2013，52（3）：3109-3112.

[5] 李姝江，王淋敏，譙天敏，等.利用響應面法優化貝萊斯芽孢桿菌ZJ20發酵參數[J].西北農林大學學報（自然科學版），2019，47（2）：1-9.

[6] 楊? 可，司? 文，林? 海，等.利用響應面分析法優化貝萊斯芽孢桿菌TCS001的發酵條件[J].農藥學學報，2019，21（4）：444-452.

[7] LUO C，CHEN Y，LIU X，et al. Engineered biosynthesis of cyclic lipopeptide locillomycins in surrogate hot Bacillus velezensis FZB42 and derivative strains enhance antibacterial activity[J].Appl Microbiol Biotechnol，2019，103（11）：4467-4481.

[8] LIM S M，YOON M Y，CHOI G J，et al. Diffusible and volatile antifungal compounds produced by an antagonistic Bacillus velezensis G341 against various phytopathogenic fungi[J].Plant Pathol J，2017，33（5）：488-498.

[9] XU T，ZHU T H，LI S J. β-1，3-1，4-glucanase from Bacillus velezensis ZJ20 exerts antifungal effect on plant pathogenic fungi[J].World J Microbiol Biotechno，2016，32（2）：26-34.

[10] 楊勝清，張? 帆，馬貴龍.貝萊斯芽孢桿菌S6拮抗物質分離純化及抑菌機理[J].農藥，2017，56（9）：645-649.