Ｏｋａｒａｍｉｎｅ類生物堿

張遵霞 王月瑩 張亞妮 張志剛 王開梅

摘要：Okaramine類生物堿是一類具有新穎殺蟲機制的天然吲哚化合物，其產生菌主要包括青霉屬（Penicillium spp.）、曲霉屬（Aspergillus spp.）的某些真菌。目前已經發現20多個Okaramine類生物堿的衍生物，大部分Okaramine類生物堿衍生物具有殺蟲活性，但其中以Okaramine B的殺蟲活性最強。構效關系研究表明，Okaramine類生物堿的殺蟲活性與氮雜環丁烷結構、氮雜環辛烷結構及C環上的甲氧基與殺蟲活性高度相關。Okaramine類生物堿作用于昆蟲神經元的谷氨酸門控氯離子通道。通過基因組挖掘、基因缺失突變、基因失活及異源表達，發現Okaramine類生物堿在真菌中的合成以色氨酸為起始單元，并在一系列成簇排列的生物合成基因的產物，包括非核糖體肽類合成酶、核黃素依賴單加氧酶、異戊烯轉移酶、P450單加氧酶、α-酮戊二酸依賴雙加氧酶及甲基轉移酶等的作用下，合成了結構豐富多樣的類似物。

關鍵詞：Okaramine;產生菌;殺蟲活性;構效關系;作用機制;生物合成

中圖分類號：Q599? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）23-0086-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.020? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Okaramines：A group of natural insecticidal indole alkaloids with new mode of action

ZHANG Zun-xia，WANG Yue-yin，ZHANG Ya-ni，ZHANG Zhi-gang，WANG Kai-mei

（Hubei Biopesticide Engineering Research Centre，Wuhan 430064，China）

Abstract： Okaramines， produced by some species of Penicillium spp. and Aspergillus spp.， are a group of natural indole alkaloids with new mode of action of insecticidal activity. Up to now， more than 20 Okaramine analogues have been discovered， and most of them showed insecticidal activity with Bombyx mori as target insect. Of the Okaramine analogues， Okaramine B showed the highest insecticidal activity. The studies on structure-activity relationship showed that the azetidine and azocine rings and the methoxy group were highly related to the insecticidal activity. Okaramines can activate the glutamate gated chloride channel in insect neurons. The okaramines were biosynthesized in fungi with tryptoan as the starting unit. Okaramines were diversely biosynthesized through the catalysis by nonribosomal peptide synthase， flavin-dependent monooxygenase， prenyltransferase， P450 monooxygenase， α-ketoglutarate-dependent dioxygenase， and methyltransferase， etc. encoded by clustered biosynthetic genes as clarified through genome mining， gene deletion and inactivation， and heterogenous expression.

Key words： Okaramine; producing microorganism; insecticidal activity; structure-activity relationship; mode of action; biosynthesis

微生物是重要生物活性化合物的源泉，其次生代謝產物在新農藥的開發中占有重要的地位。以微生物次生代謝產物直接開發或作為先導開發的農藥有阿維菌素、多殺菌素、甲氨基阿維菌素、密爾比菌素和溴蟲腈等[1]。Okaramine類生物堿是某些青霉屬（Penicillium spp.）、曲霉屬（Aspergillus spp.）真菌所產生的具有二酮哌嗪結構的含吲哚生物堿，具有較好的殺蟲活性[2，3]。研究者對該類化合物進行了大量研究，發現了一系列的衍生物，并發現了其作用機制與生物合成路徑。本研究將從Okaramine類生物堿的發現、殺蟲活性、作用機制、構效關系及其生物合成機制等方面對該化合物進行系統總結，以期為基于天然產物的新型高效殺蟲劑的開發提供一些借鑒。

1? Okaramine類生物堿的發現與生物活性

在篩選微生物所產生的殺蟲活性化合物的過程中，Murao等[2]從簡青霉（Penicillium simplicissimum）AK-40菌株中發現了Okaramine A，采用飼料法，30 μg/g的該化合物對三齡家蠶（Bombyx mori）的24 h致死率達到90%。隨后，研究者從簡青霉及曲霉屬的真菌菌株中分離到了一系列Okaramine類生物堿[3-12]。表1對Okaramine類生物堿產生菌及其所產生的Okaramine類生物堿進行了總結，表2 對Okaramine類生物堿的生物活性進行了總結。圖1顯示了所發現的Okaramine類生物堿的結構。在所有的Okaramine類生物堿中，Okaramine A～R都有一定的殺蟲活性，以Okaramine B的殺蟲活性最強，其對三齡家蠶幼蟲的毒性最強，0.3 μg/g處理24 h致死率達到100%，而LD50約為0.2 μg/g飼料。林亞偉等[10]從紅樹林真菌Aspergillus sp. OUCMDZ-1914菌株的次生代謝產物分離到的Okaramine H具有較強的糖苷酶抑制活性，IC50為3.4 μmol/L。Aspergillus taichungensis ZHN-7-07所產生的Okaramine S具有細胞毒性，其對HL-60和K-562的IC50分別為0.78和22.4 μmol/L[12]。

2? Okaramine類生物堿的作用機制與構效關系

2.1? Okaramine類生物堿的殺蟲機制

Okaramine類生物堿最早由Murao等[2]于1988年從簡青霉AK-40菌株中發現，但其殺蟲機制直到26年后才被發現。Furutani等[13]利用殺蟲活性最強的Okaramine B研究了該類化合物對家蠶幼蟲神經元的影響，結果表明，Okaramine B可以使培養的家蠶幼蟲神經元細胞產生內向電流，并且還發現煙堿受體抑制劑四甲環庚胺基本上不影響Okaramine B誘導產生的內向電流， 而配體門控氯離子通道抑制劑氟蟲腈對Okaramine B產生的內向電流有顯著影響。這初步明確了Okaramine B可能作用于配體門控氯離子通道。他們還進一步研究了Okaramine B對蟾蜍卵母細胞中表達的家蠶g-氨基丁酸門控氯離子通道及谷氨酸配體門控氯離子通道的影響，發現Okaramine B對g-氨基丁酸門控氯離子通道沒有作用，而是作用于谷氨酸門控氯離子通道，但是不能夠確定其是否作用于昆蟲體內其他的離子通道，如組氨酸門控氯離子通道或質子敏感氯離子通道等。Okaramine B基本上不影響人的g-氨基丁酸門控氯離子通道和谷氨酸門控氯離子通道，表明其在昆蟲和人之間具有很好的選擇性。

2.2? 基于殺蟲活性的Okaramine類生物堿的構效關系

在Okaramine類生物堿的衍生物中，所有氮雜環丁烷環開環或沒有氮雜環丁烷環的衍生物的殺蟲活性都下降了40～500倍（圖2及表1），說明氮雜環丁烷環結構完整性對Okaramine類生物堿殺蟲活性非常重要。Okaramine B和D結構上惟一區別在于氮雜環丁烷上3-甲基。3-甲基羥基化后，其殺蟲活性降低100倍。Okaramine B和Q的惟一區別在于C環上的甲氧基，脫去甲氧基的Okaramine Q的殺蟲活性差不多降低40倍。這表明氮雜環丁烷3-甲基及C環上的甲氧基對活性的影響很大。Shiono等[14]將Okaramine B加氫還原獲得了4個氮雜環丁烷環開環或氮雜環辛二烯被還原的衍生物，研究了Okaramine類生物堿中的氮雜丁烷環及氮雜環辛二烯環結構對活性的影響，結果發現，兩個氮雜環丁烷開環的衍生物對家蠶三齡幼蟲沒有殺蟲活性，而4，5-二氫-Okaramine B及1，2，4，5-四氫Okaramine B有一定的殺蟲活性，但殺蟲活性較Okaramine B降低許多。這證明了Okaramine B中氮雜環丁烷的環結構的完整對其殺蟲活性至關重要，而氮雜環辛二烯環上的不飽和鍵與殺蟲活性相關。這一點也從Okaramine C和G的活性差異得到證明，二者的差異在于1，2的烯鍵，這個烯鍵被還原使得殺蟲活性降低了5倍。綜上所述，Okaramine類生物堿結構中對殺蟲活性影響為氮雜環丁烷的完整性>氮雜環丁烷上3位的甲基>C環的甲氧基>氮雜環辛二烯環或其完整性。這為高活性Okaramine類生物堿的結構改造供了指導。

2.3? 基于谷氨酸門控氯離子通道的Okaramine類生物堿的構效關系

Furutani等[13]測定了具有不同結構的Okaramine A、B、I、Q及4，5-二氫Okaramine B對谷氨酸門控氯離子通道的活性，同時還比較了殺蟲活性與對谷氨酸門控氯離子通道的激活之間的關聯。結果發現，Okaramine B的激活活性較Okaramine A和I更高，這在很大程度上是由于Okaramine B具有完整的氮雜環丁烷環結構。此外，C環上的甲氧基也對其抑制活性具有重要作用。通過比較Okaramine B和二氫-Okaramine B的結構差異與其對谷氨酸門控氯離子通道的作用，可以推斷氮雜環辛二烯環可能與谷氨酸門控氯離子通道之間存在相互作用。而Okaramine類生物堿對谷氨酸門控氯離子通道的作用與其對家蠶的殺蟲活性高度相關。

3? Okaramine類生物堿的生物合成

從Okaramine類生物堿的結構可以看出它們是由兩個色氨酸通過縮合形成的二酮哌嗪類化合物。在一系列酶的作用下形成了具有多樣結構的Okaramine類生物堿。。Lai等[4]通過對Okaramine類生物堿產生菌Penicillium simplicissimum AK-40菌株的基因組進行分析，發現Okaramine類生物堿的生物合成涉及到一個雙模塊的非核糖體肽類合成酶（OkaA）、1個或2個異戊烯轉移酶（OkaC）、1個核黃素依賴的單加氧酶（OkaB）、2個P450單加氧酶（OkaD和OkaG）、1個α-酮戊二酸依賴雙加氧酶（OkaE）和1個甲基轉移酶（OkaF）。通過采用CRISP-Cas9技術，構建了多個基因缺失的突變株，進一步采用質譜分析，基本弄清了Okaramine類生物堿中Okaramine A～E及Okaramine N的生物合成路徑及其生物合成基因簇中基因的排列（圖2、圖3），最先合成Okaramine C，再在P450單加氧酶的作用下合成Okaramine N，而Okaramine N進一步脫氫氧化生成Okaramine A，而Okaramine A在α-酮戊二酸依賴雙加氧酶的作用合成了12-去羥基Okaramine E。12-去羥基Okaramine E在α-酮戊二酸依賴雙加氧酶的同時作用下生成Okaramine E，進一步在P450單加氧酶及甲基轉移酶的作用下生成Okaramine D。12-去羥基Okaramine E還可在α-酮戊二酸依賴雙加氧酶的作用下生成3-脫甲基Okaramine B，再在甲基轉移酶的作用下生成Okaramine B。該菌株中Okaramine J、H及其他Okaramine類生物堿的合成路徑及所涉及的基因還沒有確定。Lai等[4]還從其他研究者發表的Aspergillus

aculeatus的基因組序列中發現了Okaramine類生物堿合成相關的基因簇，其中有oka A～E（圖3），而該菌株可合成Okaramine A、B、H和I。可以推測，在Aspergillus aculeatus菌株中也可能存在其他Okaramine生物合成基因，使Okaramine A可以通過脫異戊烯基合成Okaramine I，再進一步通過異戊烯轉移酶的作用合成Okaramine H。Kato等[15]對Penicillium simplicissimum ATCC 90288菌株合成部分Okaramine衍生物的途徑研究發現，該菌株也是先合成Okaramine C，再合成Okaramine A，再進一步合成12-去羥基Okaramine E，最后合成Okaramine B，推測該菌株可通過Okaramine A來合成Okaramine H，但涉及到的基因及酶還不清楚。

4? 展望

Okaramine類生物堿具有很好的殺蟲活性，作用機制研究表明其作用于昆蟲神經傳導相關的谷氨酸門控氯離子通道，其對人的γ-氨基丁酸門控氯離子通道及甘氨酸門控氯離子通道基本上沒有抑制作用。這為該類化合物作為先導化合物進行安全高效的殺蟲劑的開發提供了可能。目前有關于Okaramine類生物堿的某些衍生物，如Okaramine C[16]、J[17]、M[18]和N[19]的化學合成的報道，但未見報道發現比Okaramine B殺蟲活性更好的衍生物。另外，盡管發現Okaramine類生物堿作用于谷氨酸門控氯離子通道，但沒有有關Okaramine類生物堿作用于谷氨酸門控氯離子通道的分子機制的報道，有必要開展相關的研究，為高活性Okaramine類生物堿衍生物的合成提供指導，從而推動基于Okaramine類生物堿的安全高效殺蟲劑的開發。

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