熱痹康膠囊的提取工藝研究

江麗芬 方建康 龐學豐

（廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院藥學部，廣西 南寧 530011）

熱痹康湯是龐學豐主任醫師研究且運用了十幾年的經驗方，由秦艽、防風、桂枝、威靈仙、制川烏、地龍、桑枝、葛根、忍冬藤、黃柏、蒼術等組成，對類風濕關節炎的治療或輔助治療有很好的療效。在現代類風濕關節炎的治療上，中醫藥展現了強力有效的一面，也為類風濕關節炎的治療描繪了美好的前景［1］。故本文以龍膽苦苷含量為評價指標，采用正交試驗法考察水提影響因素，優化出水提工藝條件，為研究熱痹康膠囊治療類風濕性關節炎的物質基礎、探討其作用機制及其臨床應用與開發奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 材料與儀器 ACS-JZ高密度計數計重天平（深圳信諾普衡器）；AL204分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；HH-S8電熱恒溫水浴箱（北京科偉永興儀器有限公司）；WFH-205B可見透射紫外反射儀（上海精科實業有限公司）；CQ-250超聲波清洗機（上海躍進醫用光學器械廠）；DLSB-5L/10低溫冷卻液循環泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；SHZ-D循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；LC-20AT島津高效液相色譜儀（島津國際貿易上海有限公司。）

1.2 實驗方法

1.2.1 防風的定性鑒別 取本品粉末 5 g，加甲醇30 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇10 mL使溶解，取濾液濃縮至1 mL作為供試品溶液。另取防風對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。取陰性品粉末5 g，同法制成陰性溶液。

吸取上述 3種溶液各 5 μL，點于同一硅膠 G薄層板上，以三氯甲烷 ∶甲醇（4∶1）為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光燈 254 nm下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性對照試驗無干擾。

1.2.2 桂枝的定性鑒別 取本品內容物5 g，加乙醚20 mL，振搖 15 min，放置1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加丙酮1 mL溶解，作為供試品。取桂枝藥材1 g，同法制成對照藥材。另取缺桂枝的陰性樣品，同法制成陰性對照品。吸取供試液、對照藥材及陰性對照液各 6 μL、3 μL、3 μL，分別點于同一硅膠 G薄層板上，以石油醚30～60℃-乙酸乙酯 (17∶3)為展開劑，展開取出，晾干。噴以2、4-二硝基苯肼甲醇溶液，日光下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色(橙色)的斑點，陰性對照液無此斑點。

1.2.3 黃柏的定性鑒別 取供試樣品粉末1 g加甲醇10 mL，超聲20 min，放置，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品黃柏藥材 0.1 g，同法制成對照藥材。另取缺黃柏的陰性樣品1 g，同法制成陰性對照品。取供試品溶液 10 μL、藥材對照品 5 μL、陰性對照液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-水 (6∶3∶2∶1.5∶0.3) 為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈 (365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與藥材照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，而陰性對照液與其相應位置無顯色斑點。

1.2.4 桑枝的定性鑒別 取本品 2 g，精密稱定，加甲醇20 mL，超聲處理 30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL，作為供試品溶液。取桑枝對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。另取缺桑枝的樣品1 g，同法制成陰性對照。分別吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸 (5∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈 (365 nm)下觀察。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

1.2.5 秦艽的含量測定 （1）色譜條件：柱溫：25℃；流動相：乙腈∶0.1%冰醋酸（8∶92）；流速：1.0 mL/min，檢測波長：254 nm，理論板數按龍膽苦苷峰計算應不少于3000。

（2）對照品溶液的制備：精密稱取龍膽苦苷對照品適量，加乙醇制成 1 mL含10 μg的溶液，即得。精密吸取 5 μL，進樣，測定，結果見圖 1。

圖1 對照品圖譜

（3）供試品溶液的制備：取本品約 1 g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇20 mL，密塞，超聲處理 30 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，即得。精密吸取5 μL，進樣，測定，結果見圖2。

（4）陰性干擾試驗：按照處方中藥味的比例，配制不含葛根的群藥，按其工藝制成陰性制劑，再按照上述供試品溶液的制備方法制成陰性液，精密吸取5 μL，進樣，測定，見圖3。結果陰性液在龍膽苦苷對照品相同的保留時間處未顯色譜峰，表明無干擾，方法專屬性良好。

（5）線性關系考察：精密吸取龍膽苦苷10、20、30、40、50、60 μg/mL的對照品溶液 20 μL分別注入液相色譜儀，測定龍膽苦苷色譜峰面積依次為320778、500334、673179、867796、1058561、1246075，以龍膽苦苷進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：y=185590x+128209，結果表明龍膽苦苷在0.2075～1.2047 μg具有良好的線性關系，見圖4。

圖4 龍膽苦苷色譜峰面積與進樣量線性關系圖

（6）穩定性試驗：取同一批樣品，制備供試品溶液，在室溫下放置0、1、2、4、8、12 h后分別進樣，測定峰面積，結果峰面積平均值為 653079，RSD為1.0%，表明待測組分濃度在12 h內無明顯變化，化學性質穩定。

（7）精密度試驗：取同一濃度對照品溶液，按照上述色譜條件，分別精密吸取5 μL，連續進樣6次，測定峰面積。結果峰面積平均值為 958834，RSD為 0.03%（n=6），結果表明儀器精密度良好。

（8）重復性試驗：取同一濃度供試品溶液，依法平行制備5份供試品溶液并測定其含量，結果求得龍膽苦苷平均含量為 0.786 mg/g，RSD為 0.9%（n=5）。

（9）回收率試驗：取已知龍膽苦苷含量的樣品 6份，研細，取約 1 g，精密稱定，分別精密加入葛根素對照品約0.8 mg，照供試品溶液的制備方法制備溶液并依法測定峰面積，計算回收率。結果見表1。

表1 回收率試驗 （n=6）

結果表明，本方法回收率較好。

（10）樣品含量測定：分別取九份樣品 1 g，依法制備成相同的濃度并測定其龍膽苦苷的含量，結果見表2。

表2 9份樣品含量測定

1.3 正交試驗——工藝條件優選 （1）因素水平：根據傳統的中藥制劑的常規方法及生產的實際經驗，選用水煎煮提取工藝的主要因素即加水量，第一次煎煮前滲泡時間，煎煮時間（h），煎煮次數，每個因素各選三個水平，選用L9（34）正交試驗安排試驗因素水平［3］，見表1。

表1 因素水平表

（2）試驗方法：按處方比例稱取秦艽、防風、桂枝、威靈仙、制川烏、地龍、桑枝、葛根、忍冬藤等各種藥材共9份，每份160 g，分別按 L9(34)正交試驗安排 9次試驗，合并煎煮液，精濾，濃縮，置已干燥恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣在105℃干燥4 h，放置干燥器內冷卻30分鐘，迅速稱定重量，干膏固體總量分別為 14.32、 21.97、 33.21、 33.77、 17.67、 30.52、 24.79、32.17、18.07 g。

表2 正交試驗表

結果：D＞A＞B＞C，最佳工藝：A2 B3 C1 D3

從上表的實驗數據進行方差分析結果見表3。

表3 方差分析表

（3）正交試驗優選結果：通過正交試驗直觀分析和方差分析結果表明：ABCD各因素對本品提取物總固體總量都有不同程度的影響。從分析結果表明煎煮次數D對本品影響最大，其次是加水量A，煎前浸泡時間B因素和煎煮時間，影響順序為 D＞A＞B＞C，A2B3C1D3為最佳工藝，即加10倍量水，第一次先浸泡 60 min，煎煮提取 3次，每次 1 h。

（4）驗證試驗：按優選的最佳提取工藝制備3批樣品，測定樣品的總固體量和龍膽苦苷含量，實驗結果如下表4。

表4 水提取工藝驗證結果

驗證結果表明，按水提取工藝A2B2C2D3所提取的總固體量接近正交試驗的最大值（33.77），表明此工藝穩定合理可行。

2 結果

采用正交設計，確定了水提取工藝的最佳條件，即稱取提取的藥材，加入藥材量 10倍體積的水，加熱煎煮提取3次，每次2 h，其中第一次提取前先將藥材浸泡30 min。驗證試驗結果表明此提取工藝穩定合理可行，可進行規格生產。