分子生物學技術在腸道菌群檢測中的應用研究概述

劉凡銘 郭美薇 鄒 偉

(遼寧師范大學生命科學學院 大連 116021)

人體腸道中棲息著數量巨大的微生物，它們的種類組成和活動影響著宿主的免疫、黏膜的發育和營養及藥物的代謝[1]。腸道菌群研究中如何準確有效地選擇菌群的檢測方法十分關鍵。目前腸道菌群的檢測方法大致分為兩大類，即傳統培養法和分子生物學方法。前者具有一定的局限性，如對于許多表型特征難以區別的菌種傳統分類鑒定方法就無法準確加以鑒定；后者借助分子生物學技術，可以對腸道菌群進行精準的、分子水平的檢測和分析。目前常用的分子生物學檢測技術包括16S rDNA基因序列分析法、腸桿菌基因間重復序列聚合酶鏈式反應(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction， ERIC-PCR)技術、熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization)、基因芯片技術(gene chip)及高通量測序技術(high-throughput sequencing)等，本文概述這些技術的研究進展。

1 16 S rRNA基因序列分析法

16 S rRNA基因是沉降系數為16的RNA片段，存在于所有細菌的基因組中。16S rRNA基因序列分析法利用克隆和酶切等方法從細菌樣本中獲得16S rRNA，并將其與基因文庫中細菌的16S rRNA基因序列進行比對分析，從而鑒定菌群的種類。

1.1 聚合酶鏈式反應 聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，能將微量的DNA大幅增加。其原理是利用DNA在體外95℃高溫時變性為單鏈，在60℃左右時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度(72℃左右)，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖的方向合成互補鏈，最終得到產物。而16S rRNA的PCR技術則是擴增糞便內的細菌rDNA，得到多個長度一致的16S rDNA片段，然后對這些片段進行分析測序[2]。但是由于此法利用了隨機引物，在PCR的擴增過程中容易發生交叉而造成假陽性，影響結果的準確性。

1.2 變性梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳 變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis， DGGE)是一個檢測DNA突變的電泳系統，由Fisher等發明。該技術利用特定的雙鏈DNA片段在含有從低到高的線性變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發生的變化，將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis， TGGE)是繼DGGE之后發展起來的一個DNA指紋圖譜技術，與DGGE不同的是其電泳凝膠采用的不是尿素和甲酰胺濃度梯度，而是溫度梯度。該方法利用不同構象的核酸分子具有不同的變性溫度(Tm)進行分析，但與DGGE一樣，相同DNA片段之間的單堿基對取代可以導致熔融行為的改變，且只能在一個位點內的一個小的DNA區域內檢測到序列變異。此外，DGGE與TGGE都使用毒性凝膠，因此該技術應用范圍相對較小。

1.3 熒光定量PCR技術 熒光定量PCR技術(realtime fluorescence quantitative PCR， RTFQ-PCR) RTFQ-PCR技術也稱實時PCR(Real-Time PCR)或定量PCR(Q-PCR)，是一種核酸定量技術，是在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光探針,利用熒光信號積累實時監測整個PCR反應進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。該技術具有實時監測、快速、靈敏、精確等特點[3， 4]。但是由引物二聚體、單鏈二級結構及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性。因此，其單獨使用而得到的結果是不充分、不全面的，需要結合其他技術加以輔助。

1.4 單鏈構象多態性技術 單鏈構象多態性技術(single-strand conformation polymorphism， SSCP)是一種基于DNA構象差別來檢測點突變的方法。相同長度的單鏈DNA，如果堿基序列不同，形成的構象就不同，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構象上有差異的分子分離開。在制定最佳的SSCP方法時應該考慮PCR片段的長度和凝膠運行的溫度，且凝膠濃度不合適時會出現很多雜帶，會給基因型的判定造成一定的困難。

2 ERIC-PCR分子雜交技術

隨著人們對基因序列認識的深入，Sharples等[5]于1990年發現了“基因間重復單位”，此序列重復單位主要存在于大腸桿菌中，因此被稱為腸桿菌基因間重復序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus， ERIC)，利用此序列設計引物就派生出了ERIC-PCR技術。ERIC-PCR是在隨機引物PCR(RAPD)的基礎上發展起來的對細菌DNA進行指紋圖譜分析的一種方法。該技術存在很多問題，如引物太短、退火溫度過低、不易獲得穩定的圖譜等。

3 熒光原位雜交技術

熒光原位雜交技術是一種不依賴PCR的分子雜交技術，根據堿基互補配對原則，通過特殊手段使帶有熒光物質的探針與目標DNA接合，最后用熒光顯微鏡即可直接觀察目標DNA所在的位置[6]。熒光原位雜交技術可以用于腸道菌群的檢測，但由于存在樣品自身會產生熒光、rRNA含量低、探針特異性不足等因素導致的熒光信號消退等現象，且該方法只能針對已知的目標基因序列進行引物設計，因此在使用時通常需要結合其他分子生物學技術進行分析。

4 基因芯片技術

基因芯片又稱為DNA微陣列，是一種在分子雜交技術基礎上發展起來的新型技術。基因芯片技術主要是采用光導原位合成或微量點樣等方法，將DNA探針形成DNA微陣列，然后與樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中的靶分子的數量[7]。該方法是一種能夠同時檢測多種細菌的分析方法，具有高通量、自動化、快速檢測等特點。但仍然存在許多難以解決的問題，如成本高昂、復雜、檢測靈敏度低、重復性差、分析范圍狹窄等問題[7， 8]。

5 高通量測序技術

高通量測序技術是現代生命科學研究的核心技術之一，一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定。目前比較常見的測序平臺就是Illumina Miseq高通量測序平臺。Chen等[9]利用Illumina高通量測序技術比較研究了腸易激綜合征(IBS)患者與健康供體的微生物群落差異，在IBS患者的腸道菌群中發現15個屬呈現顯著差異，并且6個屬在IBS組和正常組的小鼠糞便標本之間顯示出顯著不同的豐度。Hai-Bing等[10]利用該技術對冠心病患者和健康人16S rDNA的V3-V5區進行測序，結果表明冠心病患者腸道致病菌數量高于健康人，并且R值也偏高。高通量測序技術日益成熟，其中Illumina高通量測序技術是一種新型的測序技術，也是目前較多應用于腸道微生物研究的前沿技術。

6 結語

近年來，分子生物學技術現已廣泛應用于實驗之中，解決了形態學檢查、分離培養等傳統方法繁瑣、復雜的問題。PCR技術多用于腸道菌群研究中，并發展出rRNA/DNA-PCR序列分析、ERIC-PCR、 PCR-DGGE等分子技術，這些技術都可以揭示腸道微生態群落結構的動態變化。尤其是基于16S rRNA的分子生物學技術為腸道菌群的研究帶來了第二春。但分子生物學技術自身也有很多的缺陷，因此應結合不同的檢測技術進行腸道菌群的測定。