華南地區薇甘菊葉片揮發性有機化合物的空間差異研究

馬志輝，冀弘藝，李榮華，侯文韜，方長旬，章家恩*，王瑞龍*

1.華南農業大學資源環境學院生態學系，廣東 廣州 510642；2.農業農村部華南熱帶農業環境重點實驗室，廣東 廣州 510642；3.廣東省生態循環農業重點實驗室，廣東 廣州 510642；4.廣東省現代生態農業與循環農業工程技術研究中心，廣東 廣州 510642；5.福建省農業生態過程與安全監控重點實驗室/福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002

薇甘菊（Mikania micranthaKunth）是菊科（Asteraceae）假澤蘭屬（Mikania）多年生藤本植物，原產于熱帶中南美洲，現廣泛入侵熱帶亞洲和太平洋島嶼，對入侵地的生態系統和農林業生產，造成嚴重生態災害和經濟損失（王伯蓀等，2003）。目前我國廣東、云南、香港、澳門、臺灣受害嚴重，海南和廣西正處于危害初期（李鳴光等，2012）。薇甘菊生長速度快，繁殖能力強；同時薇甘菊的莖葉揮發物和凋落物對鄰近植物的化感抑制作用促進其快速蔓延和擴散（王伯蓀等，2003；李鳴光等，2012）。薇甘菊在我國仍有不斷擴散趨勢，防除薇甘菊已經迫在眉睫（李鳴光等，2012；Day et al.，2016；Sun et al.，2019）。

目前關于入侵植物在入侵地擴張過程中的生理生化適應機制是入侵生態學領域研究的熱點（Phillips et al.，2010；Lankau et al.，2011；Xiao et al.，2019）。研究表明大區域尺度下環境的異質性可促進外來入侵植物適應入侵地的環境條件，從而促進外來植物入侵后期的快速適應性進化（Bezemer et al.，2014）。為適應不斷變化的環境，植物演化出不同的生存策略，如通過改變基因型的適應性策略（Agrawal et al.，2015）、通過表型可塑性的生態策略（Liu et al.，2016）、通過改變防御與生長/繁殖資源分配的資源分配策略（Xiao et al.，2019），這些策略有利于入侵植物適應原產地和入侵地間不同地理環境內生物和非生物因素的變化。如通過對入侵植物美洲商陸（Phytolacca americana）沿緯度梯度（25.72°—36.15°N）開展野外調查與采樣分析，結果發現美洲商陸的生長、繁殖和防御性狀在入侵地表現出緯度梯度格局，美洲商陸在高緯度地區具有更多的分枝和更高的果實皂苷含量，這可能是美洲商陸對環境變化的一種可塑性響應（Xiao et al.，2019）。

關于非生物環境對薇甘菊入侵的影響目前主要集中單一環境因素，如光照（王文杰等，2008；李曉霞等，2018）、溫度（王瑞龍等，2012；范志偉等，2016）、水分（徐高峰等，2013；Wang et al.，2016）、鹽度（胡亮等，2014）和酸雨（宋莉英等，2013）等對薇甘菊的影響。目前綜合研究入侵地的各種環境因素對薇甘菊的影響，尤其是在華南地區不同地理種群薇甘菊葉片揮發性有機化合物的變化尚未見報道。本研究利用GC-MS對華南地區薇甘菊23個不同地理種群230個薇甘菊個體葉片揮發性有機化合物的組分進行測定，通過線性混合模型分析不同地理種群薇甘菊葉片揮發性有機化合物和自然環境因素的相關性，同時通過聚類分析和主成分分析研究不同地理種群薇甘菊葉片揮發性有機化合物組分的特征，進而探討薇甘菊在華南地區入侵地不同地理種群葉片揮發性有機化合物的變化規律，旨在為豐富和完善外來植物入侵機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

薇甘菊在華南地區 23個不同地理種群的樣品采自2018年4月（表1），選生長于背風向陽處的薇甘菊群落，每個地理種群分別采集 10個當年生長度約1 m薇甘菊幼嫩枝條作為樣本，同一種群不同樣本植株間距離保持15 m以上，以確保每個樣本來自不同的個體。不同地理種群的薇甘菊幼嫩枝條上的葉片在自然條件下風干后分別置于密封袋中待用。

1.2 樣品預處理與分析檢測

1.2.1 薇甘菊葉浸提液的制備

分別在每個地理種群的薇甘菊樣品中選取健康葉片 10片，在研缽中加入適量液氮分別將其研磨成粉狀，稱取0.2 g，置于4 mL的棕色樣品瓶中，加入4 mL正己烷（色譜純），4 ℃條件下浸提10 d，然后用0.22 μm的濾膜過濾并轉移浸提液到1.5 mL棕色樣品瓶中，放入4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 GC-MS 檢測

所用儀器為Thermo-Finnigan Trace-DSQ氣相色譜-質譜聯用儀，參考JJF 1164—2006《臺式氣相色譜-質譜聯用儀校準規范》進行校準。色譜條件：色譜柱為 DB-5MS石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。升溫程序：初溫為50 ℃，以 5 ℃·min-1升至 120 ℃，再以 2 ℃·min-1升至150 ℃，保留 2 min；分流比為 5∶1，進樣量為 1μL，進樣口溫度設置為250 ℃，載氣為氦氣，流量 1 mL·min-1。接口溫度 280 ℃，離子源溫度230 ℃，EI電離源69.9 eV，掃描范圍35—500 amu。獲得氣相色譜-質譜總離子流圖，根據NIST譜圖庫檢索，同時結合相關文獻（Bravo-Monzón et al.，2014）進行定性分析；采用色譜峰面積歸一法計算得出各化學成分的相對百分含量。

表1 華南地區23個薇甘菊種群的采集地環境信息Table 1 Environmental characteristics of 23 sampled populations of Mikania micrantha distributed in South China

1.3 采樣點地理環境信息

利用GPS定位儀精確定位采樣點的地理位置，測定經度、緯度和海拔高度。通過中國氣象數據網（http://data.cma.cn）收集采樣點所在地的年均降水量數值（表1）。

1.4 數據統計

薇甘菊葉片中揮發性有機化合物的含量采用色譜峰面積歸一法計算得出各化學成分的相對百分含量；以種群所在的地理位置信息，即經度、緯度、海拔高度、平均溫度和年均降水量作為自變量，揮發性有機化合物的峰面積作為協變量，采集種群作為隨機因子，采用線性混合模型分析氣候環境因素對薇甘菊葉片中5種主要揮發性有機化合物含量的影響；對不同地理種群的含量較多的5種揮發性有機化合物進行了主分成分析和聚類分析。所有數據用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析處理。

2 結果與分析

2.1 不同地理種群薇甘菊葉片浸提液的化學成分分析

薇甘菊葉片浸提液經GC-MS分析，通過質譜庫檢索和人工圖譜解析，結合保留指數比對，從23個不同地理種群的薇甘菊葉片中共鑒定出 42種揮發性有機化合物，利用面積歸一化計算得出各成分相對百分含量（表 2）。其中薇甘菊葉片揮發性有機化合物以倍半萜類化合物為主，其中β-蓽澄茄油烯（24.63%）、β-石竹烯（16.81%）、大香葉烯 D（10.47%）、α-古蕓烯（9.95%）和α-姜烯（9.77%）平均相對含量相對較高，這5種揮發性有機化合物在薇甘菊葉片中相對含量達71.63%（表2）。

2.2 自然環境因素對不同地理種群薇甘菊葉片主要揮發性有機化合物含量的線性混合模型分析

運用線性混合模型分析采樣地自然環境因素對薇甘菊葉片揮發性有機化合物含量的影響，分別以薇甘菊葉片中平均相對含量較高的5種揮發性有機化合物β-蓽澄茄油烯、β-石竹烯、α-古蕓烯、大香葉烯D和α-姜烯的百分比標準化后作為協變量，地理和氣候因素作為自變量，種群作為隨機因子進行分析。結果顯示，薇甘菊不同地理種群所在地的經度、緯度和年平均降水量可顯著影響其葉片中β-蓽澄茄油烯、β-石竹烯、α-古蕓烯、大香葉烯D和α-姜烯的含量。同時，海拔高度可顯著影響薇甘菊葉片中α-姜烯的含量；溫度可顯著影響薇甘菊葉片中β-石竹烯的含量（表3）。

2.3 薇甘菊葉片揮發性有機化合物與區域關聯分析

為綜合分析不同地理種群薇甘菊葉片揮發性有機化合物的變化，對比研究了不同地理種群薇甘菊葉片中含量較多的5種化合物β-蓽澄茄油烯、β-石竹烯、大香葉烯D、α-古蕓烯和α-姜烯百分比含量的差異，薇甘菊葉片中5種主要揮發性有機化合物與區域關聯分析如圖 1所示，結果發現β-Caryophyllene在河源（HYU）、梅州（MZH）、肇慶（ZQI）、云浮（YFU）、汕頭（STO）和潮州（CZH）的薇甘菊樣品中相對含量分別為 64.8%、62.1%、59.0%、55.1%、48.8%和44.9%；β-Cubebene在海口（HKO）、佛山（FSH）、清遠（QYU）、湛江（ZJI）、惠州（HZH）和東莞（DGU）的薇甘菊樣品中相對含量分別為71.5%、64.0%，61.9%、60.4%、58.2%和 56.8%；α-Gurjunene在肇慶（ZQI）、云浮（YFU）、深圳（SZH）、珠海（ZHA）、陽江（YJI）和揭陽（JYA）的薇甘菊樣品中相對含量分別為 35.0%、32.6%、22.3%、19.7%、19.5%和18.1%；Germacrene D在梅州（MZH）、河源（HYU）、汕頭（STO）、瓊海（QHA）、廣州（GZH）、深圳（SZH）的薇甘菊樣品中相對含量分別為34.4%、33.3%、28.6%、26.2%、26.0%和24.4%；α-Zingiberene在陽江（YJI）、深圳（SZH）、中山（ZSH）、瓊海（QHA）、珠海（ZHA）和儋州（DZH）的薇甘菊樣品中相對含量分別為39.8%、29.4%、29.2%、26.4%、25.9%和25.7%。結果表明薇甘菊葉片中5種主要揮發性有機化合物在不同種群中的含量具有明顯的地域特征。

2.4 不同地理種群薇甘菊葉片揮發性有機化合物的主成分分析

為評價不同地理種群薇甘菊葉片揮發性有機化合物的差異，對薇甘菊含量較多的5種揮發性有機化合物峰面積進行主成分分析。分別得到對應于2個最大特征的主成分PC1和PC2，其中PC1貢獻率為42.7%，PC2貢獻率為33.8%；這兩個主成分的累計貢獻率達76.5%；以第一和第二主成分建立坐標系，進行投影即可得到所有樣本的 PCA得分圖和載荷圖（圖 2）。得分圖可用來區分樣本，載荷圖可用來分析變量對樣本分類所起的作用。從圖中可看出，不同地理種群的薇甘菊得到很好地區分，同時地理距離較近的薇甘菊樣品揮發物有機化合物的組分相似；其中β-石竹烯（β-Caryophyllene）和大香葉烯D（Germacrene D）對第一主成分貢獻較大；β-蓽澄茄油烯（β-Cubebene）、α-古蕓烯（α-Gurjunene）和α-姜烯（α-Zingiberene）對第二主成分貢獻較大。

表2 薇甘菊葉片揮發性有機化合物相對含量Table 2 Relative percentage of volatile organic compounds from Mikania micrantha

表3 薇甘菊種群的自然環境因素對其葉片中5種揮發性有機化合物的線性混合模型分析Table 3 Linear mixed effect models of natural environmental factors on the four volatile organic compounds from Mikania micrantha

圖1 薇甘菊種群的采樣位置及其葉片中5種主要揮發性有機化合物在不同地理種群中的比例Fig.1 Sampling sites and proportions of five main volatile organic compounds in the leaves of Mikania micrantha at different geographical populations

圖2 不同地理種群薇甘菊葉片揮發性有機化合物的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of volatile organic compounds in leaves of M.micrantha from different geographical populations

2.5 不同地理種群薇甘菊葉片揮發性有機化合物的聚類分析

圖3 不同地理種群薇甘菊葉片揮發性有機化合物的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of volatile organic compounds in M. micrantha leaves from different geographical populations

為比較不同地理種群薇甘菊葉片揮發性有機化合物的差異，以含量較多的5種化合物β-蓽澄茄油烯、β-石竹烯、大香葉烯D、α-古蕓烯和α-姜烯為指標，對不同地理種群的薇甘菊進行聚類分析。由聚類分析結果可知，23個不同地理種群的薇甘菊可以分為三大類群（圖3）。第一類群為河源（HYU）、梅州（MZH）、汕頭（STO）、肇慶（ZQI）、云浮（YFU）和潮州（CZH），這一類薇甘菊樣品中β-石竹烯的相對含量較高；第二類群為江門（JME）、儋州（DZH）、陽江（YJI）、珠海（ZHA）、中山（ZSH）、深圳（SZH）和瓊海（QHA），這一類薇甘菊樣品中α-姜烯和β-蓽澄茄油烯的相對含量較高；第三類群為東莞(DGU)、清遠（QYU）、惠州（HZH）、茂名（MMI）、汕尾（SWE）、湛江（ZJI）、揭陽（JYA）、佛山（FSH）、海口（HKO）和廣州（GZH），這一類薇甘菊樣品中β-蓽澄茄油烯的相對含量較高。

3 討論與結論

3.1 討論

研究表明外來入侵植物可通過植株揮發、淋溶、根系分泌或凋落物分解向周圍環境釋放化學物質從而對鄰近植物生長產生影響（Ismail et al.，1996；Callaway et al.，2004；Wang et al.，2011；王伯蓀等，2003；李鳴光等，2012）。外來入侵植物的化感作用是其成功入侵的作用機制之一（Callaway et al.，2004）。研究表明薇甘菊葉片揮發物可促進薇甘菊的生物入侵，并對其進行化學成分分析（張茂新等，2003；馮惠玲等2004；王瑞龍等，2012）。如張茂新等（2003）利用GC-MS從薇甘菊花期地上部分揮發油中鑒定了 22種化合物，其中α-長蒎烯（9.5%）、α-律草烯（α-Humulene，7.8%）、β-雪松烯（7.1%）和姜黃烯（Curcumene，6.3%）的含量相對較多。馮惠玲等（2004）從深圳薇甘菊莖、葉精油中鑒定了51種化合物，主要成分為β-澄椒烯（12.87%）、異松油烯（Terpinolene，12.32%）和β-石竹烯（9.49%）。孫盟等（2013）從薇甘菊葉片精油中鑒定出 56種化合物，發現β-澄椒烯（17.44%）、反-羅勒烯（trans-Ocimene，8.93%）和β-石竹烯（8.39%）的含量相對較多。同時 Bravo-Monzón et al.（2014）利用GC-MS分析了太平洋和墨西哥灣熱帶流域中14個種群的165個薇甘菊樣本的葉片揮發性有機化合物的組分，發現在薇甘菊葉片中揮發性有機化合物主要成分為大香葉烯 D（35.6%）、β-石竹烯（9.8%）、檸檬烯（7.1%）和α-蒎烯（7.0%）（Bravo-Monzón et al.，2014）。本文采用Bravo-Monzón et al.（2014）相似的方法，運用GC-MS分析華南地區23個不同地理種群230個薇甘菊個體的葉片揮發性有機化合物的變化，結果鑒定了 42種化合物（表 2），其中β-蓽澄茄油烯（24.63%）、β-石竹烯（16.81%）、大香葉烯 D（10.47%）、α-古蕓烯（9.95%）和α-姜烯（9.77%）的相對含量較高。通過對比分析可知，薇甘菊葉片的揮發性有機物的組分在原產地（墨西哥）和入侵地（中國）存在較大差異，而且在入侵地不同的地理種群薇甘菊葉片的揮發性有機物的組分具有明顯的地域特征。表明從種群水平發現薇甘菊葉片揮發性萜類化合物組分的變化遵循一種鑲嵌模式，在該模式中地理因素即自然屏障具有一定作用（Bravo-Monzón et al.，2014）。

研究表明外來入侵生物可通過調節其自身生理代謝途徑來加速入侵進程（Inderjit et al.，2011；Wang et al.，2012；Alba et al.，2012）。入侵植物紫莖澤蘭（Ageratina adenophora）通過釋放揮發性有機化合物可影響入侵地鄰近植物種子的萌發和幼苗生長。紫莖澤蘭體內的揮發性有機化合物的組成在入侵地和原產地發生了變化，在入侵地（中國、印度）對土著植物表現出強烈的抑制作用，而在原產地（墨西哥）對土著植物的抑制作用較弱。表明紫莖澤蘭入侵與其體內揮發性有機化合物的生理代謝變化相關，從而促進了紫莖澤蘭的入侵（Inderjit et al.，2011）。同理入侵植物毛蕊花（Verbascum thapsus）在入侵美國后，其體內的環烯醚萜苷類（iridoid glycosides）化學防御物質的分布發生了顯著性變化，在入侵地美國，毛蕊花新葉中的環烯醚萜苷類含量比老葉高6.5倍；而在原產地歐洲，毛蕊花新葉比老葉僅高2倍，表明在入侵地中毛蕊花通過生理響應重新分配資源物質來優先保護新葉（Alba et al.，2012）。比較烏桕（Triadica sebifera）原產地種群（中國）和入侵地種群（美國）的兩大類化學防御物質的差異，發現入侵種群的類黃酮含量顯著高于原產地種群，而入侵種群的單寧含量則顯著低于原產地種群，不同類型的化學防御物質間存在權衡，表明烏桕通過調節生理代謝過程在入侵地提高了入侵競爭能力（Wang et al.，2012）。本研究發現薇甘菊在華南地區的入侵地其揮發性有機化合物的組分在不同地理種群間也存在顯著的差異，并表現出明顯的地域特征（圖 1），同時入侵地的環境因素如緯度、海拔高度等可顯著影響薇甘菊葉片揮發性有機化合物的組分。

外來入侵植物在擴散過程中，面臨的生物和非生物環境發生了很大的變化，其中非生物環境的變化與入侵種的入侵速率及入侵區域密切相關（Pellissier et al.，2014；Cronin et al.，2015；Abdala-Roberts et al.，2016）。通過分析橫跨20個緯度17個入侵地的蘆葦葉片中總酚含量的變化，發現蘆葦葉片中總酚含量在原產地和入侵地均不隨緯度發生變化，但總酚的含量在入侵地更高（Cronin et al.，2015）。長葉車前（Plantago lanceolata）葉片中環烯醚萜苷的含量隨海拔高度的增加而下降（Pellissier et al.，2014）。但是夏櫟（Quercus robur）葉片中酚類物質的含量隨著海拔高度的增加而增加（Abdala-Roberts et al.，2016）。比較分析不同緯度藍花草（Ruellia nudiflora）葉片中酚類物質的含量與環境因素的響應，發現藍花草葉片中酚類物質的含量與降水呈負相關關系，而葉片中酚類植物的含量與緯度不相關（Abdala-Roberts et al.，2016）。研究表明溫度變化可改變薇甘菊葉片中揮發性有機化合物的組分；與22 ℃相比，30 ℃時薇甘菊葉片中揮發性有機化合物α-古巴烯、α-法尼烯、α-葎草烯、α-柏木烯和β-姜烯的相對含量分別顯著增加了305.4%、37.6%、16.1%、31.1%和76.5%，同時溫度升高（30 ℃）增強了薇甘菊葉片揮發物對蘿卜（Raphanus sativus）和油菜（Brassica campestris）的根長和苗高生長的抑制作用，表明溫度升高可增強薇甘菊葉片揮發物對受體植物的抑制作用，從而促進薇甘菊的生物入侵（王瑞龍等，2012）。同時溫度升高顯著改變入侵植物五爪金龍（Ipomoea cairica）生物量分配模式的變化，即促進了其莖的生長和增加了莖的生物量分配，有利于占據更大的生存空間，進一步加劇其入侵（Wang et al.，2011）。水分脅迫可影響薇甘菊體內化感物質的生物合成，增加了土壤中化感物質的含量，增強薇甘菊入侵土壤對受體植物生長的抑制作用，薇甘菊對水分脅迫具有較強的適應性，這可能是其成功入侵的原因之一（Wang et al.，2016）。本研究運用線性混合模型分析了采樣地自然環境因素對薇甘菊葉片揮發性有機化合物含量的影響，結果顯示采樣地經度、緯度和年平均降水量可顯著影響薇甘菊葉片中β-蓽澄茄油烯、β-石竹烯、α-古蕓烯、大香葉烯D和α-姜烯的含量；同時所在地的海拔高度可顯著影響薇甘菊葉片中α-姜烯的含量；溫度也可顯著影響薇甘菊葉片中β-石竹烯的含量（表3）。

3.2 結論

本研究結果表明，華南地區薇甘菊 23個不同地理種群230個植株的葉片揮發性有機化合物以β-蓽澄茄油烯、β-石竹烯、α-古蕓烯、大香葉烯D和α-姜烯等5種化合物為主。不同地理種群的薇甘菊葉片揮發性有機化合物的化學成分基本一致，但有效成分含量存在差異；且受到采樣地經度、緯度、海拔高度和溫度等環境因素的影響，進而表現出較強的地域特征。未來需深入研究華南地區不同地理種群的薇甘菊葉片水浸提液、葉片揮發物和凋落物等對受體植物（特別是伴生的土著植物）的化感作用，揭示不同地理種群的薇甘菊葉片揮發性有機化合物的變化對薇甘菊種間競爭能力及其入侵能力的影響。本研究可為揭示薇甘菊在中國的入侵態勢及其入侵擴散機制、預測氣候變化條件下入侵植物地理格局變化及其防控措施制定提供科學指導和實踐參考。