桑黃菌發(fā)酵醬渣生產(chǎn)黃酮和蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基優(yōu)化

檀鑫榕，陳舒婷，冉早紅，郝夢(mèng)凡，金紅

（天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津300384）

食用菌深層發(fā)酵不僅菌絲體生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)利用率高，而且在發(fā)酵液中還含有相當(dāng)豐富的初級(jí)代謝產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)、多糖）和次級(jí)代謝產(chǎn)物（如黃酮、抗菌素等）[1-4]。桑黃（Phellinus igniarius）學(xué)名鮑氏層孔菌，屬于擔(dān)子菌亞門，層菌綱，多孔菌科的藥用真菌，是目前國(guó)際公認(rèn)的抗腫瘤效果最好的藥用真菌之一[5-7]。現(xiàn)已證明，桑黃含有多種藥理成分，如多糖、黃酮、香豆素等[8-12]，且在發(fā)酵過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生蛋白和黃酮等物質(zhì)，這些為富含蛋白質(zhì)和黃酮類物質(zhì)的新型食品和生物制劑的開(kāi)發(fā)提供了參考。芝麻醬渣作為香油制備過(guò)程中的廢棄物，成本低廉，多作為肥料和飼料使用，商品價(jià)值低[13]。其富含蛋白質(zhì)，脂肪和磷等元素，是很好的培養(yǎng)基基質(zhì)，同時(shí)兼顧有碳源和氮源的基質(zhì)，若將其添加到食用菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，必將為芝麻醬渣的深度利用開(kāi)辟新的途徑[14-15]。目前，桑黃在國(guó)際市場(chǎng)上供不應(yīng)求，野生桑黃資源有限，桑黃的人工栽培研究在國(guó)內(nèi)又剛剛起步，所以探索桑黃固體發(fā)酵既可以生產(chǎn)特色飼料也可以培養(yǎng)桑黃菌株，有廣闊的市場(chǎng)前景[16-17]。以桑黃菌（Phellinus igniarius，銹革孔菌屬多孔菌科）為材料，將芝麻醬渣以一定比例添加到桑黃菌的深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)發(fā)酵利用，測(cè)定發(fā)酵液中黃酮和可溶性蛋白的含量及菌絲體干重，通過(guò)正交試驗(yàn)和多指標(biāo)綜合平衡[18-22]。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，篩選出桑黃菌深層發(fā)酵生產(chǎn)黃酮、可溶性蛋白、菌絲體干重三指標(biāo)均較高的優(yōu)化培養(yǎng)基配方[23-24]，以期為我國(guó)桑黃菌的開(kāi)發(fā)提供參考，為芝麻醬渣的深度利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

桑黃菌種：由天津農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。芝麻醬渣：天津市紅旗農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場(chǎng)，80℃烘干，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、MgSO4、KH2PO4：天津市英博生化試劑有限公司；槲皮素對(duì)照品、考馬斯亮藍(lán)G-250：鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

BCM-1000A雙人雙面超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Neofuge 13R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：力康發(fā)展有限公司；LDZX-40SCI型立式電熱自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；ARC-120型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；PH050A型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；HY-5型回旋振蕩器：金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)基制備

固體斜面培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%[14]；液體種子培養(yǎng)基I：葡萄糖3%、蛋白胨0.3%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、pH自然；液體種子培養(yǎng)基II：麥麩6%、酵母浸膏0.4%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%、pH值。

1.4.2 接種及培養(yǎng)

將0.5 cm2菌塊接入固體斜面培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)至長(zhǎng)滿菌絲。用接種鏟取兩塊0.5 cm2左右的菌塊轉(zhuǎn)接入液體培養(yǎng)基I中，25℃恒溫培養(yǎng)箱48 h，之后轉(zhuǎn)入搖床在25℃、150 r/min下進(jìn)行液體培養(yǎng)，直至有均勻菌球長(zhǎng)出。此時(shí)培養(yǎng)出來(lái)的菌體即為一級(jí)菌種。將一級(jí)菌種按接種量5%接入液體種子培養(yǎng)基II中，培養(yǎng)至菌球均勻，該菌體為二級(jí)菌種。

1.4.3 菌絲體干重的測(cè)定

將桑黃菌發(fā)酵液于3 000 r/min離心10 min，過(guò)濾上清液后得到桑黃菌絲體，用蒸餾水洗滌菌絲體至無(wú)色，于恒溫干燥箱中60℃下烘干至恒重，菌絲干重測(cè)定參照文獻(xiàn)進(jìn)行[14]。

1.4.4 黃酮及可溶性蛋白含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取桑黃菌深層發(fā)酵5 d的發(fā)酵液3 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行黃酮和可溶性蛋白的含量測(cè)定，采用張靜[19]的方法進(jìn)行。以槲皮素濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，在285nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，繪出黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=36.800x+0.007 4，R2=0.996 7，具有良好的線性關(guān)系。以蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，在595 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸線性方程為：y=5.8514x+0.0021；R2=0.997 1，具有良好的線性關(guān)系。發(fā)酵液中黃酮含量（mg/mL）=提取液濃度（mg/mL）×稀釋倍數(shù)。發(fā)酵液中可溶性蛋白含量（mg/mL）=提取液濃度（mg/mL）×稀釋倍數(shù)。

1.4.5 桑黃菌發(fā)酵最佳培養(yǎng)時(shí)間的確定

將9%的芝麻醬渣添加到液體種子培養(yǎng)基II中，桑黃菌接種量為5%。25℃、150 r/min培養(yǎng)7 d。從培養(yǎng)第2天開(kāi)始每隔24 h取樣一次。樣品3 000 r/min離心10 min，取上清液，測(cè)定黃酮和可溶性蛋白的含量和菌絲體干重。確定桑黃菌發(fā)酵最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.4.6 培養(yǎng)基成分單因素條件的篩選

以發(fā)酵液中可溶性蛋白和黃酮含量及菌絲體干重為考察指標(biāo)，分別摸索醬渣濃度、酵母浸膏濃度、無(wú)機(jī)鹽MgSO4和KH2PO4濃度等單因素的影響。

1.4.6.1 醬渣濃度的影響

在液體種子培養(yǎng)基II的基礎(chǔ)上分別添加不同濃度的芝麻醬渣（0%、3%、6%、9%、12%、15%），接種量為5%。25℃、150 r/min培養(yǎng)5 d。測(cè)定醬渣濃度對(duì)黃酮、可溶性蛋白含量和菌絲體干重的影響。

1.4.6.2 酵母浸膏濃度的影響

在液體種子培養(yǎng)基II的基礎(chǔ)上分別添加不同濃度的酵母浸膏（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%），接種量為5%。25℃、150 r/min培養(yǎng)5 d。測(cè)定酵母浸膏濃度對(duì)黃酮和可溶性蛋白含量的影響和菌絲體干重的影響。

1.4.6.3 MgSO4和KH2PO4的濃度影響

在液體種子培養(yǎng)基II的基礎(chǔ)上分別添加不同濃度的 MgSO4（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）和KH2PO4（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%），接種量為5%。25℃、150 r/min培養(yǎng)5d。測(cè)定MgSO4和KH2PO4濃度對(duì)黃酮和可溶性蛋白含量的影響和菌絲體干重的影響。

1.4.7 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，按照表1設(shè)計(jì)正交設(shè)計(jì)因素表，分別以黃酮和蛋白質(zhì)含量及菌絲體干重為檢測(cè)指標(biāo)，獲得正交結(jié)果，利用SPSS17.1軟件處理和多指標(biāo)平衡法獲得最佳配方，在最佳配方基礎(chǔ)上，進(jìn)行三組平行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.4.8 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS17.1軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳培養(yǎng)時(shí)間的確定

通過(guò)考察不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑黃發(fā)酵生產(chǎn)黃酮和可溶性蛋白質(zhì)含量、菌絲體干重的影響，找出最佳培養(yǎng)時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑黃發(fā)酵液中黃酮含量的影響Fig.1 Effect of different fermentation time on the production of flavonoids in fermentation of Phellinus igniarius

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑黃發(fā)酵液中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of different fermentation time on the production of soluble protein content in fermentation of Phellinus igniarius

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中桑黃菌菌絲體干重的影響Fig.3 Effect of different fermentation days on the production of mycelium dry weight of Phellinus igniarius fermentation

從圖1可見(jiàn)，發(fā)酵液中黃酮含量在培養(yǎng)第5天時(shí)達(dá)到最大值；從圖2可見(jiàn)，發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量的變化有所不同，在培養(yǎng)第2天時(shí)，蛋白質(zhì)含量比第3天時(shí)高，之后又開(kāi)始上升直至達(dá)到最大值，即培養(yǎng)第5天時(shí)。分析原因可能是培養(yǎng)初期培養(yǎng)液中含有醬渣所致，醬渣中含有一定量蛋白質(zhì)，但隨著培養(yǎng)基消耗培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)消耗，之后再回升才是真正發(fā)酵引起的；從圖3可見(jiàn)，發(fā)酵液中菌絲體干重在培養(yǎng)第5天時(shí)達(dá)到最大值。綜合3個(gè)指標(biāo)，最佳培養(yǎng)時(shí)間確定為培養(yǎng)第5天。

2.2 培養(yǎng)基配方的單因素摸索結(jié)果

2.2.1 醬渣濃度的影響

在液體種子培養(yǎng)基II中分別添加不同濃度的芝麻醬渣（0%、3%、6%、9%、12%、15%），接種量為5%。25℃、150 r/min培養(yǎng)5 d。測(cè)定醬渣濃度對(duì)黃酮、可溶性蛋白含量和菌絲體干重的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4～圖6。

圖4 不同濃度芝麻醬渣對(duì)桑黃菌深層發(fā)酵液中黃酮含量的影響Fig.4 Effect of different concentration of sesame sauce residue on flavonoids content produced in fermentation broth

圖5 不同濃度芝麻醬渣對(duì)桑黃菌深層發(fā)酵液中可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effect of different concentration of sesame sauce residue on the content of soluble protein produced in fermentation broth

圖6 不同濃度芝麻醬渣對(duì)桑黃菌深層發(fā)酵液中菌絲體干重的影響Fig.6 Effect of different concentration of sesame sauce residue on dry weight of mycelia produced in fermentation broth

從圖4～圖6中可以看出，黃酮含量、可溶性蛋白含量及菌絲體干重隨著醬渣濃度的升高先上升后下降。醬渣濃度為9%時(shí)，黃酮含量達(dá)到最大值2.112 mg/mL，可溶性蛋白含量達(dá)到最大值1.365 mg/mL，菌絲體干重達(dá)到最大1.34 g。綜合分析得到最優(yōu)醬渣濃度為9%。

2.2.2 酵母浸膏濃度的影響

在液體種子培養(yǎng)基II分別添加不同濃度的酵母浸膏（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%），接種量為5%。25℃、150 r/min培養(yǎng)5 d。測(cè)定酵母浸膏濃度對(duì)黃酮和可溶性蛋白含量的影響和菌絲體干重的影響，結(jié)果見(jiàn)圖 7～圖 9。

圖7 不同濃度酵母浸膏對(duì)桑黃菌深層發(fā)酵液中黃酮含量的影響Fig.7 Effect of different concentration of yeast extract on flavonoids content produced in fermentation broth

圖8 不同濃度酵母浸膏對(duì)桑黃菌深層發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量的影響Fig.8 Effect of different concentration of yeast extract on the content of soluble protein produced in fermentation broth

圖9 不同濃度酵母浸膏對(duì)桑黃菌深層發(fā)酵液中菌絲體干重的影響Fig.9 Effect of different concentration of yeast extract on dry weight of mycelia produced in fermentation broth

從圖7～圖9中可以看出，黃酮含量、可溶性蛋白含量和菌絲體干重隨著酵母浸膏的升高先上升后下降。酵母浸膏為0.4%時(shí)，黃酮含量達(dá)到最大值1.211mg/mL，可溶性蛋白含量達(dá)到最大值1.352 mg/mL，菌絲體干重達(dá)到最大值1.25 g。綜合分析得到最優(yōu)酵母浸膏濃度為0.4%。

2.2.3 不同濃度MgSO4和KH2PO4的影響

在液體種子培養(yǎng)基II分別添加不同濃度的MgSO4（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）和KH2PO4（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%），接種量為5%。25℃、150 r/min培養(yǎng)5 d。測(cè)定MgSO4和KH2PO4濃度對(duì)黃酮和可溶性蛋白含量的影響和菌絲體干重的影響，結(jié)果見(jiàn)圖10～圖15。

圖10 不同濃度MgSO4對(duì)桑黃菌深層發(fā)酵液中黃酮含量的影響Fig.10 Effect of different concentration of MgSO4on flavonoids content produced in fermentation broth

圖11 不同濃度MgSO4對(duì)桑黃菌深層發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量的影響Fig.11 Effect of different concentration of MgSO4on the content of soluble protein produced in fermentation broth

圖12 不同濃度MgSO4對(duì)桑黃菌深層發(fā)酵液中菌絲體干重的影響Fig.12 Effect of different concentration of MgSO4on dry weight of mycelia produced in fermentation broth

從圖10～圖12中可以看出，黃酮含量、可溶性蛋白含量和菌絲體干重隨著MgSO4濃度的升高先上升后下降。MgSO4濃度為0.1%時(shí)，黃酮含量達(dá)到最大值1.27 mg/mL，可溶性蛋白含量達(dá)到最大值1.23 mg/mL，菌絲體干重在MgSO4濃度為0.15%時(shí)達(dá)到最大值1.24 g。綜合分析得出最優(yōu)MgSO4濃度為0.1%。從圖13～圖15中可見(jiàn)，黃酮含量、可溶性蛋白含量和菌絲體干重隨著KH2PO4濃度的升高先上升后下降。KH2PO4濃度為0.25%時(shí)，黃酮含量和菌絲體干重達(dá)到最大值分別為1.28 mg/mL和1.35g，可溶性蛋白含量在KH2PO4濃度為0.20%和0.25%時(shí)相差不大，達(dá)到最大值1.38 mg/mL，綜合分析得出最優(yōu)KH2PO4濃度為0.25%。

圖13 不同濃度KH2PO4對(duì)桑黃菌深層發(fā)酵液中黃酮含量的影響Fig.13 Effect of different concentration of KH2PO4on flavonoids content produced in fermentation broth

圖14 不同濃度KH2PO4對(duì)桑黃菌深層發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量的影響Fig.14 Effect of different concentration of KH2PO4on the content of soluble protein produced in fermentation broth

圖15 不同濃度KH2PO4對(duì)桑黃菌深層發(fā)酵液中菌絲體干重的影響Fig.15 Effect of different concentration of KH2PO4on dry weight of mycelia produced in fermentation broth

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 正交試驗(yàn)因素表

根據(jù)篩選出的單因素結(jié)果，進(jìn)行四因素四水平正交試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素表Table 1 Four factors and four levels orthogonal test

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

按照表1設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)因素表進(jìn)行四因素四水平的正交實(shí)驗(yàn)，以黃酮和蛋白質(zhì)含量及菌絲體干重為測(cè)定指標(biāo)獲得結(jié)果，并采用SPSS17.1軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 四因素四水平正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test of four factors and four levels

從表2可見(jiàn)，以黃酮含量為考察指標(biāo)，得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為A4B3C4D1；以蛋白質(zhì)含量為考察指標(biāo)，得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為A4B2C1D1；以菌絲體干重為考察指標(biāo)，得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為A4B3C4D3。各個(gè)培養(yǎng)基配方稍有不同。為了得到3個(gè)指標(biāo)均較好的配方，采用綜合平衡法進(jìn)行多指標(biāo)分析，篩選獲得能兼顧黃酮和可溶性蛋白、菌絲體干重3個(gè)指標(biāo)均衡的培養(yǎng)基優(yōu)化方案。

2.3.3 多指標(biāo)綜合分析法獲得優(yōu)化配方

對(duì)因素A和C的分析：對(duì)三指標(biāo)A4水平均最好；對(duì)因素B的分析：對(duì)于黃酮含量和菌絲體干重來(lái)說(shuō)，B3水平最好。對(duì)于可溶性蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，B2水平最好，B3水平次之，綜合3個(gè)指標(biāo)，選擇B3水平；對(duì)因素C的分析：對(duì)于可溶性蛋白含量和菌絲體干重來(lái)說(shuō)，均以C4最好，對(duì)于黃酮含量來(lái)說(shuō)，C1水平最好，C4水平次之，綜合因素C選擇C4水平；對(duì)D因素的分析：對(duì)于黃酮含量和菌絲體干重說(shuō)，D1水平最好。對(duì)于蛋白質(zhì)含量來(lái)說(shuō)，D3水平最好，D1水平也不差，綜合分析選擇D1。根據(jù)綜合平衡法，篩選出的最優(yōu)培養(yǎng)基為配方為A4B3C4D1，即：醬渣12%、酵母浸膏0.4%、KH2PO40.25%、MgSO40.05%。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最優(yōu)配方進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得黃酮含量為2.033 mg/mL、可溶性蛋白質(zhì)的含量1.667 mg/mL，菌絲體干重為1.866 g。

3 討論與結(jié)論

芝麻醬渣中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以作為食用菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分，但芝麻醬渣含有大量的鹽分，添加過(guò)多會(huì)抑制食用菌的生長(zhǎng)[13]。試驗(yàn)用的醬渣是芝麻磨成油之后的副產(chǎn)品，本身含有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在菌體發(fā)酵過(guò)程中菌體得以應(yīng)用，菌體長(zhǎng)勢(shì)良好。芝麻醬渣可以代替麥麩作為桑黃菌液體發(fā)酵的培養(yǎng)基成分，并且添加后黃酮與可溶性蛋白的含量均較高，生產(chǎn)成本低。

桑黃發(fā)酵添加9%芝麻醬渣后，黃酮和可溶性蛋白的含量及菌絲體干重較其他醬渣濃度下高。最佳發(fā)酵時(shí)間為第5天。以黃酮和可溶性蛋白質(zhì)含量及菌絲體干重為多指標(biāo)篩選出的最佳培養(yǎng)基配方為：芝麻醬渣12%、酵母浸膏0.4%、KH2PO40.25%、MgSO40.05%，經(jīng)過(guò)3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到黃酮的含量為2.033 mg/mL，可溶性蛋白質(zhì)的含量為1.667 mg/mL，菌絲體干重為1.866 g。