降脂紅曲發酵工藝的研究進展

程玉冰，胡海峰，*，閔濤玲

（1.中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院，上海201203；2.國藥集團健康產業研究院有限公司，上海 201203）

近年來，高膽固醇血癥發生率正以驚人的速度增長，由于其可引發多種心血管疾病并發癥，因此嚴重威脅到公眾健康。使用降脂藥物治療高膽固醇血癥存在較多副作用，因此通過服用食品或功能性產品來達到降脂療效[1]，引起了廣大的關注。紅曲菌在次級代謝的過程中，可產生具有降脂活性的莫納可林K（Monacolin K，以下簡稱MK）。服用含有MK的紅曲制品既可降脂，又能避免藥物引發的副作用，在降脂市場上占有重要地位。

1 降脂紅曲的發展歷史

紅曲是指將紅曲菌接種于適宜發酵基質后經培養所得的發酵物，屬于我國傳統的藥食同源發酵產品，是我國寶貴的科學文化遺產。在我國古代，紅曲又稱為丹曲，《本草綱目》中曾記載：“紅曲以白飯蒸罨成紅色，與營血有同氣相求之理，能生血而健脾，氣溫達肝，味甘益脾之力也”。古代對紅曲的食療作用定義為：“消食、活血、健脾、燥胃”。近年來，隨著國內外研究者對紅曲的深入研究，其顯著的降脂活性被發現。在20世紀70年代，日本的微生物學家Akira Endo和Merck&Co.制藥公司的研究人員從紫紅曲霉中分離出了monacolins類物質，此后紅曲作為一種非處方膳食補充劑，成為洛伐他汀類藥物的替代品，活躍在降脂市場中[2]。在20世紀90年代，臨床試驗表明紅曲含有他汀類藥物洛伐他汀的天然形式，能夠像他汀類藥物一樣有效地降低膽固醇[3]。因此加強對紅曲的深入研究，加強對紅曲制品監管力度，使紅曲制品標準化，確保紅曲食用安全性迫在眉睫。

2 紅曲菌發酵的主要成分

紅曲菌在次級代謝的過程中，可產生MK，MK（圖1）即洛伐他汀，其化學結構中含有β-羥基內酯基團[4]，其內酯環經開環反應后，β-羥基內酯基團可轉化為β-羥基酸，成為MK的酸式結構（圖2），MK的酸式結構與膽固醇合成過程中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）還原酶的結構最為相似，因而能夠阻斷膽固醇合成通路，降低膽固醇合成。Monacolin K的內酯形式與它的羥基酸產物在不同pH值條件下可以相互轉化，經人體產生的羥基酶水解后，發揮降脂活性。目前，MK的生產主要依靠生物發酵法，生物發酵能夠避免化學法生產所具有的反應條件苛刻、副反應多、產品分離純化困難等一些缺點，具有一定優勢[5]。工業生產中主要涉及的他汀產生菌包括土曲霉、紅曲霉、青霉菌及鏈霉菌[6]。與其他發酵菌株相比，紅曲發酵物中活性物質更加豐富，且其固體發酵物可不經提取分離，直接作為保健食品所食用，因而有更大優勢。

另外，紅曲菌具有豐富的聚酮合成體系，能夠產生多種豐富的代謝產物：除具有顯著降脂活性的MK外，其還可產生具有降壓及抗抑郁活性的γ-氨基丁酸，研究表明[7]，在小鼠抗抑郁實驗的長期測試中，提供相同劑量的γ-氨基丁酸及紅曲發酵物，后者具有比γ-氨基丁酸更好的抗抑郁效果，有更大的研究潛力。近年來，隨著人們對色素需求量的日益增加，利用微生物來生產色素凸顯出巨大的優勢：微生物易培養，色素產量高、易獲得、可避免化學合成色素所帶來的危害[8]，具有廣闊的發展前景。紅曲色素作為一種優質的天然可食用色素，具有多種優勢：紅曲色素穩定性好、具有抗炎[9]及抗菌[10]活性，可成為有致癌隱患—亞硝酸鹽的替代品，在著色的同時還可發揮抑菌作用。另外，在紅曲豐富的菌絲體中還含有具有抗氧化活性的輔酶Q10[11]；紅曲還可產生各種豐富酶類，如淀粉酶、酯化酶、糖化酶等。但是，紅曲菌發酵也會產生一種具有致癌活性的真菌毒素—桔霉素，因此，在提高目標產物的同時，控制桔霉素的產生也尤為重要。對紅曲進行不同程度的菌種篩選及不同性質的工藝優化，改變其次級代謝方向，可使促其提高相應代謝產物的產量。正是這些豐富的代謝產物，使紅曲擁有極高的研究價值，在微生物開發與利用發展史上占有重要地位。

圖1 莫納可林K結構式[3]Fig.1 Chemical structures of Monacolin K[3]

圖2 酸式莫納可林K結構式[3]Fig.2 Chemical structures of Monacolin K hydroxy acid[3]

3 MK的生物合成

MK是由紅曲霉聚酮化合物合成酶（polyketides，PKS）合成的次級代謝產物。其有2條生物合成途徑[12]見圖3：一條在合成過程過程中形成中間體，進一步轉化為莫納可林 L（Monacolin L）、莫納可林 J（Monacolin J），最后形成MK；另一條在合成過程中形成二甲基丁酰輔酶A，進一步合成MK。

為提高紅曲MK產量，一些與紅曲霉MK生物合成基因簇有關的基因成為了研究熱點。通過對MK生物合成相關基因進行鑒定，研究者[13]發現了9個和洛伐他汀生物合成基因同源性較高的基因簇（圖4），推測它們編碼MK蛋白質的合成基因：mokA和mokB用于合成肽鏈骨架；P450單氧酶基因（mokC），氧化還原酶基因（mokD），脫氫酶基因（mokE），轉酯酶基因（mokF），HMG-CoA 還原酶基因（mokG），轉錄因子基因（mokH）及外排泵基因（mokI）。

將mokA基因破壞后[14]，菌株不再產生MK，表明mokA編碼與MK生物合成相關的PKS基因；將mokB基因破壞后[15]，菌株不再產生MK，且Monacolin J含量升高，表明mokB編碼側鏈多肽部分的PKS生物合成基因；mokH基因編碼Zn（II）2Cys6雙核DNA結合蛋白，研究表明[16]，mokH可以上調MK生物合成基因的轉錄，促進MK的產生。

圖3 Monacolin K的生物合成途徑[12]Fig.3 Monacolin K biosynthetic pathway[12]

圖4 Monacolin K的生物合成基因簇[13]Fig.4 Monacolin K biosynthetic gene cluster[13]

4 降脂紅曲的發酵工藝質控點

紅曲發酵是多因素共同作用的綜合性發酵，其發酵合成MK受多種因素影響，如菌種、接種量、發酵培養基及其營養組成、發酵溫度、發酵pH值等。固體發酵則更為復雜，除上述幾種因素外，固態發酵基質、發酵基質初始含水量及翻曲均對紅曲固體發酵合成MK有較大影響。

4.1 菌種篩選

目前，可采用紫紅曲菌、橙色紅曲菌、叢毛紅曲菌、血紅紅曲菌[17]或兩種紅曲菌混合發酵[18]來促進MK的合成。但是，并非所有的紅曲菌都具有MK合成能力，因此篩選一株具有MK產生能力的紅曲菌株是發酵試驗的關鍵。在自然分離篩得具有MK產生能力紅曲菌株的基礎上結合菌株改造是得到高產菌株的有效方法：如李桂航等[19]使用雙滅活原生質體融合方法成功選育出紅曲霉洛伐他汀高產菌株；此外，利用紫外、射線或化學誘變劑，均有可能獲得高產紅曲突變株。某些經過誘變的菌株在獲得高產MK能力的同時，也可能喪失桔霉素產生能力[20]，一舉兩得，可大大提高發酵物安全性。但由于霉菌菌絲體存在異核現象，誘變并非全部核發生變異，再次培養時，正突變結果難以保持，為試驗重復性帶來一定困難[21]。近年來，隨著對洛伐他汀生物合成途徑及其分子生物學認識的逐步深入，使用基因工程手段改造菌株，提高紅曲洛伐他汀的產量成為可能[22]。

4.2 接種量的選擇

接種量是指接入發酵培養基的種子培養物的體積：接種量過高，菌株生長迅速，營養利用較快，發酵可利用營養不足，導致發酵周期縮短，產量受限；接種量過低，菌株生長緩慢，發酵周期延長。另外，最適接種量會隨培養基營養成分變化而變化[23]且對固體發酵而言，接種會引入發酵基質水分。因此，選擇合適的接種量對紅曲發酵產MK有較大影響，研究表明，接種量5%時能明顯促進MK合成[24]。

4.3 發酵溫度的選擇

紅曲菌能夠在較大溫度范圍內（25℃～40℃）生長，但利于其發酵合成MK的溫度卻相對較為苛刻。研究表明[25]，在30℃培養6天后，25℃培養15 d的變溫培養條件下，其菌絲量低于30℃恒溫培養組，但其MK產量比恒溫條件高16倍。這是由于25℃的培養條件更利于MK合成基因簇的表達及與次級代謝有關蛋白的表達，抑制了菌絲生長蛋白的表達。Tao Huang等[26]則發現，高溫條件更利于某些色素合成基因簇的表達，促進部分色素合成。

4.4 發酵pH值的選擇

紅曲菌嗜酸，其生長最適pH值范圍為3.5～5。較低的pH值能夠抑制雜菌生長，維持紅曲菌優勢生長環境，但同時可能造成紅曲細胞數量過多增殖而導致桔霉素產量升高，如CHUN-LIN LEE等[27]研究發現，當pH值降至2.5時，紅曲細胞量增加，其MK及桔霉素產量均升高；當pH值升至5.7時，其MK產量較對照組提高了47%，桔霉素產量降低了54%。BiyuKang等[28]則發現氮源直接影響發酵終點的pH值變化，而pH值變化又進一步影響紅曲菌某些次級代謝產物的合成，因此通過調節培養基中的氮源添加比例來控制發酵pH值變化，可調控菌株的次級代謝進程。Bibhu Prasad Panda等[29]在進行發酵工藝參數優化時發現，發酵培養基的pH值對多種工藝參數均有促進作用。因此，加強對發酵pH值動態變化監測，探究其變化對紅曲基因表達的影響，是調控紅曲菌次級代謝的重要研究方向。

4.5 固體發酵初始含水量的選擇

水是紅曲菌菌絲生長、孢子形成及次級代謝產物合成必不可少的物質，選擇適宜的初始含水量既有利于菌株生長代謝，又能避免由于發酵后期補水造成的染菌風險。含水量的選擇對發酵狀態影響較大：初始含水量過高，菌絲旺盛生長，基質結塊難以疏散，不利于氧氣傳遞、廢氣排出，阻礙菌株生長及MK合成；初始含水量過低，物料干硬，不利于菌株生長及酶系傳遞。Fusheng Chen等[30]研究發現，當初始含水量控制在55%～75%時，菌株發酵的MK產量相對較高。另外國藥集團健康產業研究院有限公司實驗室在紅曲發酵過程中發現，菌株在生長代謝消耗基質中的營養，基質保水能力下降，在發酵中后期會產生游離水。發酵游離水的產生會使底部基質長期泡在液體中，溶氧極差且濕度過高粘于瓶壁不易翻曲，不利于菌株生長及發酵。因此，如何選擇最優初始含水量，控制游離水產生，也是提高紅曲固體發酵MK產量的關鍵因素。

4.6 發酵培養基的選擇

現階段的紅曲發酵主要以固體發酵及液體發酵為主，兩種發酵方式各有其特色。紅曲固體發酵，主要指將紅曲菌接種于不含或僅含有少量水的固態基質如大米、小米等，進行的一種發酵。研究表明[20]，紅曲固體發酵過程中，細胞生長、甘油消耗及MK的產生均比液體發酵快；固體發酵基質細胞膜流動性和滲透性比液體發酵好；且固體發酵基質構成了一個碳源濃度梯度微環境[31]，可減少代謝阻遏，利于菌株生長及產物合成。但是固體發酵工藝復雜，為紅曲工業化生產帶來一定困難。紅曲液體發酵周期短、污染率小、易控制，但MK產量普遍低且后處理成本高。

4.6.1 固體發酵底物及附加營養的選擇

紅曲固體發酵最常使用的發酵底物為大米，其較高的淀粉含量及較好的保濕性很適合紅曲菌生長及代謝產物合成。另外，除使用單一大米作為發酵底物外，也可使用其他物質代替大米或復配大米作為發酵底物，提高MK的產量：Burcu Atll等[32]認為，使用粒度為1 mm～2 mm的大麥作為固體發酵基質，既能滿足菌株生長代謝的營養需求，又能提高溶氧，經工藝優化后，MK 產量可達 139.47 mg/g；Patcharee Pattanagul等[33]選用具有多種藥用價值的薏仁作為發酵基質，在篩得高產MK菌株的同時，該菌株發酵物中的桔霉素含量明顯下降；N.Jaivel等[34]使用疏松且富含豐富礦物質及微量元素的麥麩作為發酵基質，能夠獲得比高粱基質、玉米基質、米糠基質更高產量的MK；Rashmi Dikshit等[16]也發現，使用麥麩作為發酵基質能夠獲得比多種水果種子基質及米糠基質更高產量的MK。除上述幾種基質外，還可使用其他工業或農業廢料[35]作為發酵基質，既能降低成本、提高利用價值，又可以保護環境，是紅曲固體發酵的一個新研究方向。

營養成分影響菌絲生長、孢子萌發、細胞增殖及菌落形態變化。在選擇合適發酵基質的基礎上，附加一定量營養物質，是提高發酵MK產量的重要策略。Jirasatid等[36]使用響應面優化試驗篩得一較優發酵工藝：在使用大米作為基礎發酵基質的基礎上，附加2%甘油、0.14%甲硫氨酸和0.01%硝酸鈉，發酵MK產量可得5 900 mg/kg，且在此工藝下其黃色素產量也有較大提升，桔霉素產量下降；Fusheng Chen等[30]在使用大米混合少量麥麩發酵基質基礎上，附加一定量營養肉湯培養基（葡萄糖、谷氨酸鈉、蛋白胨、硝酸銨、磷酸二氫鉀），對MK的合成有明顯促進作用；Bo-BoZhang等[37]使用小粒徑且低黏度的小米作為發酵基質，并在此基礎上附加20%甘油及3.5%豆粕，其發酵MK產量最高可達19.81 mg/g。

4.6.2 液體發酵培養基的選擇

紅曲液體發酵是一個不斷變化的發酵過程，隨著菌株對營養物質的利用，發酵液中會發生一系列pH值[38]及氧化還原電位[39]的變化，這些變化會調控某些與紅曲次級代謝有關的基因簇，影響代謝產物的合成。與固體發酵相比，對液體發酵進行營養組分優化更簡便可行，選擇合適的營養因子并加以優化，是提高紅曲液體發酵MK產量的有效方法。

甘油是紅曲發酵中常用的營養物質，其既可以作為碳源供菌株生長利用，又可以作為發酵前體因子，刺激菌株MK合成。添加適量甘油能夠促進MK合成，但高濃度甘油會抑制某些MK合成相關基因的表達，不利于MK生產[40]。Subhagar Seraman等[41]通過響應面優化試驗發現，葡萄糖、蛋白胨、硫酸錳、氯化鈉、氯化銨均對MK合成有較大影響，經工藝優化后，發酵14 d時MK產量可達97.5 mg/L；Yaw-Nan Chang等[42]對米粉、葡萄糖、甘油、蛋白胨進行響應面優化試驗，篩得一較優工藝，驗證后其MK產量可達131.0 mg/L；Sadik Ali Sayyad等[43]對葡萄糖、氯化銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳5個參數進行優化，優化后MK產量可達351mg/L；Chan Zhang等[44]研究發現谷氨酸可以上調部分MK合成基因表達，促進細胞中MK分泌，經工藝優化后，MK產量提高了3.5倍；Jun Zhang等[45]通過添加MK合成前體檸檬酸鈉后，產量提高了52.6%；添加能夠增強細胞膜通透性的表面活性劑Triton X-100后，產量較對照組提高了86.9%。

5 展望

隨著對降脂紅曲的深入探索，其未來的可研究熱點包括：1）加強對菌株基因工程改造的研究，提高菌株MK產生能力；2）在提高紅曲菌發酵MK產量的同時，提高其他活性代謝產物的產量并加強代謝產物安全性研究：如Jing Huang等[46]研究發現，亞油酸作為一種信號分子能夠促進MK合成基因的表達，提高MK產量，與此同時，低濃度的亞油酸也有利于紅曲色素的產生；Jyh-Jye Wang等[47]對發酵溫度、水分及乙醇添加量進行工藝優化后，發酵的MK、γ-氨基丁酸產量均提升且桔霉素產量下降；Yuan-Chi Su等[48]在篩得高產MK菌株的基礎上進行發酵組分營養優化，在優化后的工藝下，MK及γ-氨基丁酸產量均提高。因此，在進行紅曲工藝優化的同時，提高其兩種或多種次級代謝產物產量，控制桔霉素產生，能夠大大提高試驗效率及紅曲產品安全性，是紅曲發酵新的研究方向；3）在降脂紅曲的基礎上，研究紅曲新的活性方向：如紅曲除熟知的降壓降脂等生物活性外，其還可作為一種自由基清除劑[49]，發揮抗氧化活性；最新研究表明紅曲還具有抗癌活性[50]：其可以阻滯腫瘤細胞的正常生長、抑制腫瘤細胞形成、促進腫瘤細胞凋亡從而發揮抗癌作用。但是關于其抗癌機制還待進一步深入研究。