真空冷凍干燥棘孢木霉菌株工藝優(yōu)化研究

龍艷珍，吳菲菲，2，李化強(qiáng)，2，*，趙良忠，2

（1.邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南邵陽(yáng)422000；2.湖南省果蔬清潔加工工程技術(shù)研究中心，湖南邵陽(yáng)422000）

酶法加工已遍布各行各業(yè)，而在果蔬加工中主要應(yīng)用到的許多重要酶制劑，如果膠酶、纖維素酶等都依賴進(jìn)口，進(jìn)口意味著果蔬加工生產(chǎn)成本高，行業(yè)發(fā)展受到嚴(yán)重限制，而棘孢木霉（Trichoderma asperelham）發(fā)酵可產(chǎn)生一系列對(duì)細(xì)胞壁具有水解作用的水解酶，如纖維素酶、果膠酯酶、果膠裂解酶等[1]，另外，棘孢木霉菌株還可應(yīng)用于生物防治方面[2-4]，且效果良好。在團(tuán)隊(duì)前期的研究中發(fā)現(xiàn)，所篩選出的棘孢木霉菌株發(fā)酵液[5]具有降解柑橘白皮層和囊衣的作用且降解效果較好，這與前人對(duì)棘孢木霉菌株產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶、N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶、幾丁質(zhì)酶、果膠酶等[6-9]的研究一致。另外，在將棘孢木霉應(yīng)用到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，菌株的貯藏、活化、制備及運(yùn)輸，都存在諸多問(wèn)題，如活化時(shí)間長(zhǎng)、貯藏條件要求高、需要冷鏈運(yùn)輸?shù)惹闆r。綜上，采用真空冷凍干燥技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行凍干處理，以便保藏及應(yīng)用。

常見且易于實(shí)現(xiàn)的菌種保藏法為甘油法[10-11]，其操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單，適用范圍廣[12]，但需要低溫冰箱常年冷凍且菌種的保藏期限不確定。真空冷凍干燥技術(shù)是既能完成凍干任務(wù)又能很好的保護(hù)目標(biāo)物活性的一種技術(shù)[13]。在九十多年的研究中，真空冷凍干燥技術(shù)的應(yīng)用潛力被大量的開發(fā)，其中有人用于研究菌種的保藏[14-17]、食品原料的干制[18-19]、活性成分的干制[20-22]等方面，取得了良好的效果。與其他方法相比，真空冷凍干燥技術(shù)處理菌株存活率較高，菌株活性保持較好，遺傳特性較為穩(wěn)定，復(fù)水再生性良好、便于長(zhǎng)期儲(chǔ)存和不易變質(zhì)等[23-24]。近些年，前人將真空冷凍干燥技術(shù)用于保藏霉菌菌種如白地霉[25]、黑曲霉[15]、棒曲霉[14]等，但關(guān)于棘孢木霉真空冷凍干燥的研究鮮有報(bào)道。

本文主要是通過(guò)真空冷凍干燥技術(shù)將棘孢木霉菌液有效的轉(zhuǎn)化成相對(duì)穩(wěn)定、易于運(yùn)輸?shù)募吣久咕郏藸顟B(tài)下的菌種輕便、干燥，在運(yùn)輸、應(yīng)用及保藏方面相當(dāng)便捷。另外，通過(guò)將凍干后的菌粉進(jìn)行復(fù)蘇發(fā)酵培養(yǎng)，探究?jī)龈商幚韺?duì)棘孢木霉發(fā)酵穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棘孢木霉菌Trichoderma asperelham（中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏號(hào)為CGMCC No：14636）作為本試驗(yàn)的目的菌株，由湖南省果蔬清潔加工工程技術(shù)中心從湖南邵陽(yáng)柑桔園中采樣獲得，再?gòu)囊越燮し蹫橹饕煞值倪x擇性培養(yǎng)基[26]中分離得出。挑選品質(zhì)相同、大小相似的市售湘西椪柑為供試果實(shí)。

脫脂牛奶：莫萊高博恩共營(yíng)有限公司；Evans blue：生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；銀湖SP-780加氧泵：中山市日勝電器制品有限公司；DW-FL450A1超低溫冷凍儲(chǔ)存箱：中科美菱低溫科技股份有限公司；BA310 Digital顯微鏡：麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；SW-CJ-1D凈化工作臺(tái)：蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；IS-RDD3恒溫振蕩培養(yǎng)箱：美國(guó)精騏儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 制備凍干菌粉的工藝流程

取-40℃40%甘油管保藏的棘孢木霉菌，溶解，在無(wú)菌條件下接入液體培養(yǎng)基[26]中，在30℃、160 r/min下培養(yǎng)48 h，活化培養(yǎng)兩次，然后用接種環(huán)將棘孢木霉菌接種于斜面培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，30℃培養(yǎng)6 d，備用。挑取斜面培養(yǎng)基中的棘孢木霉劃入空白平板中，30℃下培養(yǎng)6 d，然后，在無(wú)菌工作臺(tái)中，以5 mL無(wú)菌水將成熟的孢子洗出，裝入10 mL無(wú)菌螺口試管中，制取得孢子懸液，根據(jù)血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定孢子的數(shù)量，用以確定孢子濃度，按要求調(diào)配脫脂牛奶的添加量，然后在-40℃冰箱中進(jìn)行預(yù)凍，再進(jìn)行真空冷凍干燥，收集干粉，制備得發(fā)酵劑。

1.2.2 菌液濃度測(cè)定

選用血球計(jì)數(shù)板法對(duì)菌懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，即將菌懸浮液放在血球計(jì)數(shù)板與蓋片之間的計(jì)數(shù)室中，使用計(jì)數(shù)板25×16規(guī)格進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取其平均值。公式如下：

1.2.3 菌種存活率測(cè)定

采用伊文思藍(lán)作為活菌計(jì)數(shù)的染色劑[27]，伊文思藍(lán)作為一種活性染料，可對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行著色，而未失活的細(xì)胞由于排異的作用而出現(xiàn)透明的情況，從而實(shí)現(xiàn)活菌計(jì)數(shù)。通過(guò)血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算得活菌數(shù)。菌種凍干存活率的計(jì)算：W/%=n2/n1×100式中：n1為未進(jìn)行冷凍干燥前活菌數(shù)，個(gè)/mL；n2為凍干菌粉復(fù)水至凍干前體積活菌數(shù)，個(gè)/mL。

1.2.4 發(fā)酵液制備

凍干結(jié)束后，將菌粉以凍干前相同體積的無(wú)菌水在無(wú)菌條件下復(fù)溶，取出5 mL計(jì)數(shù)用，取1 mL 1×107個(gè)/mL加入到裝有500 mL桔皮粉液體培養(yǎng)基的1 000 mL錐形瓶中，在30℃、160 r/min條件下，培養(yǎng)時(shí)間 72 h，離心取上清液（4℃，10 min，3 800 r/min），備用。

1.2.5 發(fā)酵液降解試驗(yàn)

采用8瓣/200mL（500mL塑料燒杯），功率為5W、氣壓為0.025MPa的加氧泵進(jìn)行鼓泡，降解溫度為50℃，待其達(dá)到70%降解效果后，取出，記錄降解所需時(shí)間。

1.2.6 發(fā)酵液降解效果評(píng)價(jià)指標(biāo)

參考李杰等[28]對(duì)柑橘橘皮及囊衣降解效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)并做相應(yīng)修改，感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下：

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of Ponkan segments

1.2.7 單因素試驗(yàn)

1.2.7.1 保護(hù)劑添加量的確定

在菌液濃度為1×108個(gè)/mL，預(yù)凍時(shí)間為12 h的情況下，選定凍干保護(hù)劑添加量分別為14、16、18、20、22%5個(gè)水平進(jìn)行真空冷凍干燥，每個(gè)水平3組平行，以存活率、橘瓣降解時(shí)間為指標(biāo)，獲得最佳的保護(hù)劑添加量。

1.2.7.2 菌液濃度的確定

在保護(hù)劑添加量為20%，預(yù)凍時(shí)間為12 h的情況下，將菌液的濃度分別調(diào)配成 1×106、1×107、1×108、1×109個(gè)/mL 4個(gè)水平進(jìn)行凍干處理，每個(gè)水平3組平行，以存活率、降解時(shí)間為指標(biāo)確定最佳菌液濃度。

1.2.7.3 預(yù)凍時(shí)間的確定

在保護(hù)劑添加量為20%、菌液濃度為1×108個(gè)/mL的情況下，選定預(yù)凍時(shí)間為12、18、24、30 h 4個(gè)水平進(jìn)行真空冷凍干燥處理，每個(gè)水平3組平行，以存活率、降解時(shí)間為指標(biāo)確定最佳真空冷凍干燥預(yù)凍時(shí)間。

1.2.8 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定最佳真空冷凍干燥工藝條件，因素水平表見表2。

表2 正交試驗(yàn)水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，每個(gè)處理重復(fù)3次，采用Eexcel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 保護(hù)劑添加量

保護(hù)劑添加量與存活率及橘瓣降解時(shí)間的關(guān)系見圖1。

圖1 保護(hù)劑添加量與存活率及橘瓣降解時(shí)間的關(guān)系Fig.1 The relationship between content of cryoprotectant and servival rate and the degradation time of Ponkan segments

由圖1可知，保護(hù)劑添加量從14%到20%之間，菌株的存活率上升速度最快，降解時(shí)間也逐漸變短，而20%之后菌株的存活率增長(zhǎng)緩慢，降解時(shí)間逐漸趨于穩(wěn)定。綜上，選擇凍干保護(hù)劑添加量為20%進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

2.1.2 菌液濃度

菌液濃度與存活率及橘瓣降解時(shí)間的關(guān)系見圖2。

圖2 菌液濃度與存活率及橘瓣降解時(shí)間的關(guān)系Fig.2 The relationship between the concentration of bacterial solution and servival rate and the degradation time of Ponkan segments

由圖2可知，菌液濃度從1×106個(gè)/mL到1×108個(gè)/mL之間，菌株的存活率呈急劇上升的趨勢(shì)，降解時(shí)間逐漸變短，在1×108個(gè)/mL時(shí)，存活率達(dá)到最大值，降解時(shí)間達(dá)到最小值，而1×108個(gè)/mL之后菌株的存活率下降，降解時(shí)間加長(zhǎng)。綜上，選擇菌液濃度為1×108個(gè)/mL進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

2.1.3 預(yù)凍時(shí)間

預(yù)凍時(shí)間與存活率及橘瓣降解時(shí)間的關(guān)系見圖3。

圖3 預(yù)凍時(shí)間與存活率及橘瓣降解時(shí)間的關(guān)系Fig.3 The relationship between pre-freezing time andand servival rate and the degradation time of Ponkan segments

由圖3可知，預(yù)凍時(shí)間在24 h時(shí)，存活率達(dá)到最大值，降解時(shí)間達(dá)到最小值，而少于或超過(guò)24 h菌株的存活率下降，降解時(shí)間延長(zhǎng)。可能的原因是預(yù)凍時(shí)間太長(zhǎng)導(dǎo)致菌株死亡或失去活性，而預(yù)凍時(shí)間短物料未能預(yù)凍完全，在抽真空的過(guò)程中發(fā)生飛灑而導(dǎo)致其損失。綜上，選擇最佳預(yù)凍時(shí)間為24 h。

2.2 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析Table 3 Experimental design and result of orthogonal experiments

根據(jù)極差Rs、Rd可判斷出各因素對(duì)真空冷凍干燥工藝的影響為：B＞A＞C（菌液濃度＞保護(hù)劑添加量＞預(yù)凍時(shí)間）。從表3中我們看出，棘孢木霉的最佳凍干工藝為A2B2C2，即菌液濃度為1×108個(gè)/mL，脫脂牛奶保護(hù)劑添加量為20%，預(yù)凍時(shí)間為24 h。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳條件下，即菌液濃度為1×108個(gè)/mL，脫脂牛奶保護(hù)劑添加量為20%，預(yù)凍時(shí)間為24 h，進(jìn)行真空冷凍干燥處理，重復(fù)3次，菌株的存活率達(dá)到81.25%，橘瓣的降解時(shí)間為31 min，由此可見，經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥處理后，棘孢木霉活性保持良好。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定棘孢木霉菌株的最佳真空冷凍干燥工藝參數(shù)為：保護(hù)劑添加量為20%，預(yù)凍時(shí)間為 24 h，菌液濃度為 1×108個(gè)/mL，在最優(yōu)條件下，菌株的存活率達(dá)到81.25%，橘瓣降解所需時(shí)間為31 min為木霉菌的真空冷凍干燥提供參考依據(jù)，也為菌株保藏和運(yùn)輸帶來(lái)了便捷。